HPLC法測定鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量

林忠寧，張珍麗，吳樟強，曾建偉

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建福州350013；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京100081；3.福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司，福建龍巖364001；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

HPLC法測定鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量

林忠寧1，張珍麗2，吳樟強3，曾建偉4

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建福州350013；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京100081；3.福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司，福建龍巖364001；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的建立鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的質(zhì)量控制方法。方法用Agilent HC-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86），體積流量：1m L／m in，檢測波長：256 nm，進樣量：10μL，柱溫：30℃。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的進樣量在10.6～212 ng、21.5～430 ng、20.4～408 ng，與峰面積呈良好的線性關(guān)系；蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率為99.61%、98.87%、98.09%。結(jié)論HPLC法簡便、準確、可靠，可用于鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的質(zhì)量控制。

鬼針草；蘆丁；金絲桃苷；異槲皮苷；高效液相色譜法

鬼針草（Bidens bipinnata L．）為菊科（Compositae）一年生草本，具有清熱解毒、利濕退黃、散瘀活血的功效，主治感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡癤。鬼針草的主要成分為總黃酮［1］，對心肌缺血再灌注大鼠、急慢性肝損傷小鼠有保護作用［2－5］，對肝纖維化大鼠有治療作用［6－7］，能改善過敏性紫癜患者的微脈管炎癥［8］，還有顯著的抗關(guān)節(jié)炎作用［9］。鬼針草中的黃酮含量測定已有報道［10-14］，但未見測定鬼針草中蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的報道。我們用福建和臺灣的鬼針草樣品，用HPLC法測定鬼針草中蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的含量，為鬼針草的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1　儀器與試劑

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（G1311C四元泵，G7167B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器）（美國安捷倫公司）；LK-1000A搖擺式中藥粉碎機（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AR2130千分之一電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（法國Millipore公司）；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、磷酸等為分析純。

1.2試藥蘆丁（批號：100080-201507）、金絲桃苷（批號：111521-201503）、異槲皮苷（批號：111809-201501）（中國食品藥品檢定研究院）；鬼針草采自福建省和臺灣省各地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓副教授鑒定為菊科植物鬼針草Bidens bipinnata L．的干燥全草。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent HC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；流量：1 mL／min；檢測波長：256 nm：進樣量：10μL：柱溫：30℃。在此色譜條件下，混合對照品HPLC圖見圖1，供試品HPLC圖見圖2。

2.2混合對照品溶液精密稱取蘆丁對照品2.12 mg，金絲桃苷對照品2.15 mg，異槲皮苷對照品2.04 mg，分別置于10 mL瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得各自儲備液。精密吸取3種儲備液0.5、1、1 mL于同一10 m L瓶中，加入甲醇稀釋并定容至刻度，得濃度分別為10.6、21.5、20.4μg／mL的混合對照品溶液。

2.3供試品溶液精密稱定鬼針草粉末2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL，稱定重量，500 W、50 kHz超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，進行回歸分析，得到：

蘆丁的回歸方程為：

Y＝2.805 X+58.67 r＝0.999 5

金絲桃苷的回歸方程為：

Y＝3.681 X+1.599 r＝0.999 4

異槲皮苷的回歸方程為：

Y＝5.760 X+25.86 r＝0.999 8

蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷線性范圍為10.6～212、21.5～430、21.5～430 ng。

2.5精密度試驗精密吸取混合對照品溶液，重復(fù)進樣6次，記錄色譜峰面積，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD為1.11%、1.38%、1.25%。

2.6穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液，每隔2 h進樣1次，共進樣6次，記錄色譜峰面積，計算鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD為0.99%、0.31%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗取同一批鬼針草粉末2 g，共6份，按2.3項的方法制備供試品溶液，進樣，記錄峰面積，計算鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量平均值為0.09、0.12、0.11 mg／g，RSD為1.69%、1.24%、1.99%。

2.8回收率試驗精密稱取已知含量的鬼針草（福建永定）粉末1 g，6份，置具塞錐形瓶中，每份分別加入0.42 mL蘆丁儲備液、0.55 mL金絲桃苷儲備液和0.53 mL異槲皮苷儲備液，按2.3項的方法制備供試品溶液，進樣，計算蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的平均回收率，見表1。

2.9含量測定對采自福建和臺灣各地的鬼針草藥材，按2.3項的方法制備供試品溶液，按2.1項的色譜條件進樣，測定，記錄峰面積，并按外標法計算含量，結(jié)果見表2。

3　討論

3.1檢測波長的選擇經(jīng)二極管陣列檢測器于200～400 nm在線掃描得知，3個對照品在256 nm、352 nm處有吸收峰，且前者吸光度大于后者。為提高檢測靈敏度，我們選擇256 nm為檢測波長。

3.2流動相的優(yōu)化由于被檢測成分均為黃酮，存在酚羥基，呈弱酸性，故在流動相中加入0.1%磷酸以抑制解離，防止峰的拖尾。乙腈比例增大，金絲桃苷與蘆丁的峰粘在一起，乙腈比例減小，金絲桃苷與異槲皮苷的峰粘在一起。為使較難分離的3個峰達到完全分離，最佳比例確定為乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）。

表1　蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的回收率試驗結(jié)果（n＝6）

表2　鬼針草中蘆丁，金絲桃苷，異槲皮苷的含量mg／g

3.3提取條件考察比較回流提取與超聲波提取，二者差別不大。考慮到超聲波操作簡單，受熱溫度低，故選擇超聲波提取。考察了不同濃度的乙醇提取效果，發(fā)現(xiàn)60%乙醇提取率最高，故選擇60%乙醇作為提取溶劑。

3.4品質(zhì)評價由表2可知，采自福建和臺灣各地的鬼針草中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量差異較大。臺灣產(chǎn)鬼針草中黃酮含量明顯高于福建產(chǎn)的，這為評價海峽兩岸鬼針草藥材品質(zhì)提供了一種參考。

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R284.2

B

1000-338X（2016）05-0023-03

2016-07-01

福建省科技項目資助課題（2014R1017-2），福州市科技計劃項目資助課題（2013-G-107）

林忠寧（1972—），男，副研究員，主要從事藥用植物資源與開發(fā)利用研究。

曾建偉（1976—），男，副研究員。E-mail：zjwtcm@qq.com