2015年上海地區豬鏈球菌的檢測與分析

張維誼 王曉旭 沈莉萍 徐 鋒 寧 昆 齊新永

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

2015年上海地區豬鏈球菌的檢測與分析

張維誼 王曉旭 沈莉萍 徐 鋒 寧 昆 齊新永

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

對2015年上海地區豬屠宰場、豬養殖場、臨床病死豬開展豬鏈球菌的分離檢測，主要包括對豬唾液、豬鼻拭子、豬場空氣樣本、扁桃體、肺臟等共363份進行細菌分離和PCR鑒定，共分離到豬鏈球菌43株，對這43株細菌開展mrp、orf2、s1y、gdh、gapdh、epf、fbps 7種主要毒力因子檢測，通過對病原的分析，了解上海地區豬鏈球菌病的疫情動態和趨勢，為防控豬鏈球菌病提供依據。

豬鏈球菌；檢測；分型；毒力因子

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是革蘭氏陽性球菌，屬于鏈球菌屬馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. equi），主要存在于豬扁桃體和鼻腔中，也存在于生殖道和消化道中，屬國家規定的二類動物疫病，也是一種重要的人畜共患病原菌。豬鏈球菌在全世界范圍內廣泛存在，并且嚴重影響各國養豬業的發展。豬鏈球菌根據其多糖莢膜的抗原性差異，目前已發現有35個血清型（l～34型和1/2型）（陳經雕，2008）［1］，主要的毒力因子有谷氨酸脫氫酶（gdh）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、胞外因子（epf）、溶血素（sly）、纖連蛋白結合蛋白/纖連蛋白（fpbs）、毒力相關序列（orf2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

本研究采用傳統的細菌分離培養與分子生物學PCR結合的鑒定技術，對上海地區養殖場、屠宰場和臨床門診開展豬鏈球菌病的流行情況調查，并對病原進行血清型分型和毒力因子檢測，旨在摸清上海地區豬鏈球菌病的疫情動態和趨勢，為防控豬鏈球菌病提供依據。

1 材料

1.1 樣本

來自2015年上海地區豬養殖場、豬屠宰場和本中心畜禽臨床樣本，主要包括養殖場中小豬唾液樣本、豬鼻拭子樣本、環境樣本，生豬屠宰場肺臟、扁桃體和下頜淋巴結樣本以及門診中病/死豬內臟樣本。

1.2 主要試劑和儀器設備

1.2.1 培養基、診斷試劑

Columbia血瓊脂基礎，脫纖維羊血購自閔行區諸翟無菌動物血試劑供應站，革蘭氏陽性細菌鑒定卡（GP）、引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，Premix購自TaKaRa公司。

1.2.2 標準菌株

豬鏈球菌標準株SS2 由德國吉森大學Baljer 教授惠贈。

1.2.3 儀器

全自動微生物生化鑒定系統（VITEK2-Compact）、普通PCR儀（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 樣本采集和處理

2.1.1 小豬唾液樣本：將滅菌棉繩捆綁在食槽，待小豬咬食棉繩10分鐘后，將棉繩中唾液擰至采樣袋。共采集2家豬場豬唾液樣品，36份樣品。吸取100ul唾液涂于培養基培養。

2.1.2 環境樣本：用空氣浮游菌采樣器對豬場空氣進行樣品采集，空氣流量設為100cm3/S，采集3s，每棟豬舍采集2份標本，共計32份樣品。對樣本直接進行培養。

2.1.3 養殖場中豬鼻拭子樣本：用滅菌棉簽，伸入豬鼻腔內深處，旋轉2圈，采集豬鼻拭樣本。每季度采集2個區，每次2個豬場，每個場10份鼻拭。直接涂于培養基培養。

2.1.4 屠宰場內臟樣本：無菌采集豬屠宰場肺臟、扁桃體和下頜淋巴結樣本于樣品袋內。上下半年分4次采集3個豬屠宰場的140份樣品進行豬鏈球菌分離。上半年肺臟、扁桃體和下頜淋巴結各20份，下半年采集肺臟、扁桃體各30份。用滅菌生理鹽水沖洗扁桃體和肺臟組織，無菌采取扁桃體和肺臟組織涂抹接種培養基培養。

2.1.5 病/死豬內臟樣本：無菌采集死亡豬的肝、脾、肺、心、淋巴結、扁桃體等組織，腦膜炎病例還采集腦組織等樣品；對局部感染病例，無菌采集關節液及其周圍組織或局部膿液。

2.2 細菌分離培養

按要求將樣本涂抹接種于Columbia血平板（加入1μl/ml過濾除菌的NAD和5～10%脫纖維綿羊血），在5%CO2培養箱中經36℃培養24～48h，對可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個菌落接種于Columbia血平板進行純培養，觀察菌落特征，染色特點。

2.3 細菌鑒定

參照文獻［2］合成豬鏈球菌的引物，具體見表1。PCR反應體系為25μl：premix 12.5μl，引物各0.5μl，ddH2O 8.5μl，模板2μl。反應條件為：94℃預熱5 min；94℃30s，56℃30s，72℃1 min，擴增30個循環；72℃延伸10 min。

表1 豬鏈球菌二重PCR檢測引物

2.4 豬鏈球菌主要毒力因子檢測

參照李小軍等［2］建立的兩組多重PCR方法檢測mrp、orf2、sly、gdh、gapdh、epf、fbps 7種主要毒力因子。具體方法見參考文獻。

3 結果

3.1 細菌分離鑒定

經24h培養，對α溶血、灰白色、濕潤、表面光滑、邊緣整齊、1mm大小菌落染色鏡檢，G+球菌，2～5個鏈，經Columbia血平板24h純培養，菌落提取DNA模板，進行豬鏈球菌二重PCR檢測，共43份陽性。對豬鏈球菌PCR陽性菌株在VITEK2-Compact和VITEK MS上進行鑒定，均為豬鏈球菌屬。

3.2 分離檢測結果

2015年從363樣本中共分離到57株豬源致病性鏈球菌，其中共鑒定出豬鏈球菌43株，總陽性率為11.85%，具體見如下數據：

從36份豬唾液樣本分離到到6株，分離率為16.67%；從80份豬鼻拭中分離到16份豬鏈球菌，分離率為20%；從140份屠宰場內臟樣本中分離出豬鏈球菌7株，分離率為8.75%，均來自上半年扁桃體內臟，未從其他組織分離到豬鏈球菌；32份空氣樣品未檢測到豬鏈球菌。

2015年從75份臨床病例中分離到14例豬鏈球菌病臨床病例，從豬發病表現來看，臨床上關節炎型、敗血癥型、腦膜炎型分別占35.7%、28.6%、21.4%；14例豬鏈球菌病臨床病例多以混合感染為主，單純鏈球菌感染病例很少見（2，14.29%）。臨床常見的病例偽狂犬+豬鏈球菌（3，21.43%）豬藍耳病+豬鏈球菌（3，21.43%）。

3.3 豬鏈球菌主要毒力因子檢測結果

gdh、gapdhgdh、orf2 3種毒力因子大部分菌株都能檢出，gdh、gapdh這2種毒力因子的檢測率最高，達95.34%，orf2的檢出率其次，70.07%，50%菌株能檢出mrp、fbps，但epf、sly檢查率低，分別為39.53%、25.58%。

4 分析

自20世紀50年代初期證實豬鏈球菌是豬腦膜腦炎、關節炎的主要病原以來，荷蘭、英國、美國、加拿大、澳大利亞、新西蘭、巴西、丹麥、日本、中國（包括臺灣省）等先后報道了豬鏈球菌病。1998年-1999年夏季在我國江蘇省部分地區豬群中暴發流行并導致特定人群感染致死的也是豬鏈球菌，2005年又在四川爆發生豬因感染鏈球菌發病死亡的案例，可見豬鏈球菌不僅多畜牧業造成巨大危害，也對人類公共衛生安全產生了嚴重威脅。本研究選擇豬鏈球菌有重要意義，從檢查結果看陽性率達11.85%，要重視豬鏈球菌病的防控。

豬鏈球菌的天然定植部位是上呼吸道，尤其扁桃體和鼻腔中，在本研究中分離率最高的是從豬養殖場的80份豬鼻拭中分離到16份豬鏈球菌，分離率為20%；而從140份屠宰場的扁桃體中分離出豬鏈球菌7株，分離率為8.75%，扁桃體分離率低于豬鼻拭的分離率。此外，在養殖場的空氣樣品未檢測到豬鏈球菌，這可能間接證明空氣中未含有豬鏈球菌。

豬鏈球菌培養條件要求嚴格，在室溫下僅少量存活，專門需要在體內環境中生長［3］，體外存活時間短，采集的樣品需要在沒有使用抗生素之前。目前沒有找到添加何種抗生素進行豬鏈球菌增菌，直接進行平板培養，如果采集的樣品污染嚴重，分離更加困難，今后需加強對豬鏈球菌增菌培養的研究。

研究表明，豬鏈球菌致病性強弱與其毒力因子密切相關。其中mrp和epf是強毒株的標志，sly為一種巰基活化類毒素，在菌體入侵和裂解細胞的過程發揮作用。其他獨立因子均與細菌的致病性有著密切的關系。研究中有50%菌株檢出mrp，39.53%的菌株檢出epf，說明有近4成的豬鏈球菌為強度株。

［1］ 李小軍.上海地區豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學調查［D］.南京農業大學，2007.

［2］ 趙德明，張仲秋，周向梅.豬病學［M］.北京：中國農業大學出版社，2014：800-801.

［3］ 李鵬，何永聚，馮書章.豬鏈球菌2型新毒力相關基因的研究進展［J］.中國生物制品學雜志，2011，24（3）：362-365.

張維誼（1979—），女，碩士，高級獸醫師，一直從事動物疫病的檢測、監測、診斷和技術推廣工作。

研究來源：滬農青字（2014）第2-12 號和滬農科攻字（2014）第7-3-3號