表皮生長因子受體基因突變與肺腺癌亞型關系的研究

李 歆,徐韞健，張承和美

(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，廣州 510095；2.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科,廣州 5101200；3.廣州醫科大學生物技術2011級，廣州 528244)

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·論 著·

表皮生長因子受體基因突變與肺腺癌亞型關系的研究

李 歆1,徐韞健2，張承和美3

(1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，廣州 510095；2.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科,廣州 5101200；3.廣州醫科大學生物技術2011級，廣州 528244)

目的 探討表皮生長因子受體(EGFR)基因突變類型與肺腺癌亞型的相關性。方法 收集2011～2015年該院3 028例非小細胞肺腺癌(NSCLC)患者的腫瘤組織，提取DNA后采用突變阻滯擴增系統(ARMS)檢測EGFR基因突變。結果 3 028例NSCLC患者標本中， EGFR基因突變率為39.7%，其中第19號外顯子缺失突變543例，第21號外顯子L858R點突變535例，共占89.8%；新分類中浸潤前病變與微浸潤性腺癌、浸潤性腺癌的EGFR基因突變比較，差異有統計學意義(P<0.05)；中分化肺腺癌有較高的EGFR突變率,不同分化程度的EGFR突變率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 新分類表現出與分子診斷的相關性，不同亞型EGFR突變率有差異，EGFR基因突變與腺癌組織分化程度存在一定的相關性。

肺腺癌； 表皮生長因子受體； 基因突變； 亞型

肺癌已成為發病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺腺癌(NSCLC)占原發性肺癌的80%[1]。近年來，肺腺癌發病率逐漸上升，已成為最常見的肺癌類型。分子靶向藥物治療是目前腫瘤治療的最新策略之一，肺癌分子靶向治療藥物代表為表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)。表皮生長因子受體(EGFR) 基因突變與 EGFR-TKI靶向藥物的臨床療效密切相關。通過 EGFR 基因檢測可篩選出最合適的患者進行有針對性的靶向治療，從而顯著提高藥物療效。有研究發現EGFR突變和肺腺癌的某些特殊亞型相關,如貼壁樣為主型的腺癌具有更高的 EGFR突變率,對EGFR-TKI也更為敏感[2]。有研究報道，EGFR 突變與含乳頭狀和微乳頭狀亞型成分的腺癌呈正相關，與此相反，黏液性細支氣管肺泡癌(BAC)的EGFR突變率卻非常低[3-4]?，F探討不同肺腺癌亞型與EGFR基因突變的關系，為臨床用藥提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集腫瘤醫院2011～2015年臨床確診的NSCLC患者3 028例，獲取組織標本。根據國際多學科肺腺癌新分類標準[5-6]：Ⅰ型為浸潤前病變：非典型腺瘤樣增生、原位腺癌(包括非黏液型、黏液型、黏液/非黏液混合型)；Ⅱ型為微浸潤性腺癌(包括非黏液型、黏液型、黏液/非黏液混合型)；Ⅲ型為浸潤性腺癌：貼壁樣生長為主型(原來的非黏液型BAC)、腺泡樣為主型、乳頭狀為主型、微乳頭狀為主型、實性為主型伴黏液產生；Ⅳ型為浸潤性腺癌變異型：浸潤性黏液腺癌(原來的黏液型BAC)、膠樣型腺癌、胎兒型腺癌(低分化和高分化)、腸型腺癌。

1.2 儀器與試劑 人類EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)和石蠟組織DNA提取試劑盒均購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司；微量紫外分光光度計購自美國Thermo fisher scientific公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3 方法 (1)石蠟切片標本病理評估：抽取用于檢測的連續切取石蠟切片1張，HE染色。高倍鏡下選擇切片上、下、左、右、中5個視野，每個視野連續計數30個細胞，合并5個視野結果，計算平均腫瘤細胞含量作為標本的腫瘤細胞含量。(2)DNA提?。簢栏癜凑瞻屡涮资灲M織DNA提取試劑盒說明書進行操作。所提DNA經微量紫外分光光度計檢測提取質量并確定含量，DNA的A260/A280在1.8～2.0之間，石蠟組織DNA 于-20 ℃ 保存。(3)加樣：分別向45 mL待測標本DNA(約3.5 ng/μL)、陽性質控品和陰性對照加入2.25 μL Taq酶，混勻后依次取5 μL加入8聯PCR管反應條的每孔中。(4)PCR反應參數：95 ℃ 5 min，1個循環；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環。在第3階段60 ℃收集信號。

1.4 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較使用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGFR基因突變類型與突變率結果比較 3 028例NSCLC患者標本中，EGFR基因突變率為39.7%。突變類型為第19號外顯子缺失突變最多，占45.2%；其次為 第21號外顯子L858R點突變，占44.6%。見表1。

表1 EGFR基因突變類型與突變率結果比較

2.2 新分類組織亞型與EGFR基因突變結果比較 1 201例EGFR基因突變NSCLC患者標本中，有217例病理分型不明確，不納入統計。在新分類中，腺泡樣為主型的浸潤性腺癌例數最常見，占40.4%，其次是乳頭狀為主型的浸潤性腺癌，占18.1%；腺泡樣為主型的浸潤性腺癌有較高的EGFR基因突變率(70.9%)，浸潤前病變、微浸潤性腺癌、浸潤性腺癌和浸潤變異型的EGFR基因突變比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 組織亞型與EGFR基因突變的結果比較[n(%)]

2.3 分化程度與EGFR基因突變的結果比較 603例有明確分化程度的標本中，低分化肺腺癌所占比例較多(54.9%)，高分化較少(2.3%)，而中分化肺腺癌則有較高的EGFR突變率(38.4%)，且不同分化程度的EGFR基因突變率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 分化程度與EGFR基因突變的結果比較[n(%)]

注：χ2=11.297 1；P=0.003 5。

3 討 論

國外有學者發現肺腺癌亞型與 EGFR 突變狀態密切相關，并認為 EGFR 突變在非黏液性BAC、乳頭狀和微乳頭狀腺癌亞型中發生率更高，而在其他組織學亞型中發生率較低，尤其在黏液性BAC亞型中EGFR突變率更低[2,4]。本研究結果表明，EGFR突變多見于微浸潤性和浸潤性(貼壁樣、腺泡樣、乳頭狀、微小乳頭狀為主型)肺腺癌，而EGFR突變率在非典型瘤樣增生、浸潤性黏液腺癌則相對較低；膠質樣腺癌、胎兒型腺癌、腸腺癌標本量較少，因此突變率也較低。與有關報道基本一致[7]?；旌嫌蟹丘ひ盒?BAC成分和以乳頭狀成分為主的腺癌都可預測高 EGFR 突變率,而含黏液性 BAC成分的腺癌突變率較低。

有關組織學亞型與EGFR突變之間的密切聯系，目前仍不清楚其真正原因。有研究報道，外周型肺腺癌主要起源于終末細支氣管的Clara細胞和肺癌Ⅱ型上皮細胞，在該型腺癌中，甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)的表達常為陽性；位于中央氣道的腺癌主要起源于支氣管基底細胞和黏液分泌細胞，TTF-1的表達為陰性[8]。有學者研究顯示， TTF-1 在肺癌組織學分型等方面有著一定的作用，分別從其蛋白表達和 mRNA 水平進行研究，可作為鑒別組織學分型的標志物[9]。層序聚類分析也提示，2個差異的基因簇分別對應終末呼吸單位(TRU)和非終末呼吸單位(N-TRU)來源的腺癌。Yatabe[10]研究證實，TRU來源的腺癌是一種特別的腺癌類型，與細支氣管肺泡癌特征非常符合，表現出獨特的細胞學形態，以及TTF-1和細胞表面蛋白表達。有實驗研究顯示，在149例TRU 腺癌中，EGFR突變率為61.1%，97例EGFR突變患者中，高達91例(93.8%)為TRU腺癌。TRU腺癌預測EGFR突變具有高敏感性和特異性，對EGFR-TKI治療更為有效。

關于肺癌組織分化程度與EGFR基因突變的關系，國內外文獻少有報道。本研究對603例有明確分化程度的肺腺癌標本進行EGFR突變分析，發現中分化肺腺癌有較高的EGFR突變率，且不同分化程度的EGFR基因突變率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，與黃光輝等[11]的研究相似。高、中、低分化基因突變率分別為35.1%、50.6%、23.7%,說明EGFR基因突變與NSCLC腺癌組織分化程度存在一定的相關性。

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Association of EGFR mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma

LIXin1,XUYunjian2,ZHANGChenghemei3

(1.DepartmentofMedicalLaboratory,HospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095，China；2.DepartmentofMedicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou,Guangdong510120,China；3.DepartmentofBiotechnology2011Grade,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong528244,China)

Objective To assess the association of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma.Methods Lung cancer tissues were collected from 3 028 cases of patients with non-small cell lung cancer,DNA was extracted respectively,and EGFR gene exons 18,19,20 and 2l mutations were dectected by ARMS-PCR amplification.The association of EGFR mutation with histologic subtypes in lung adenocarcinoma was analyzed.Results The mutation rate of EGFR detection was 39.7%，most were exon 19 del and exon 21 L858R (proportion 89.8%);according to the new classification,EGFR gene mutation in infiltrating lesions with micro infiltrating adenocarcinoma and infiltrating adenocarcinoma were different(P<0.05).EGFR mutation rates were higher in moderately differentiated lung adenocarcinoma,degree of differentiation of EGFR mutation rates were statistically different(P<0.05).Conclusion The new classification showes a correlation with molecular diagnosis,different subtypes of EGFR mutation rate is different.There is a certain correlation between EGFR gene mutation and the degree of differentiation in adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma； epidermal growth factor receptor； gene mutation； histologic subtype

李歆,女,主管技師，主要從事臨床檢驗技術研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.007

A

1673-4130(2016)20-2820-03

2016-04-11

2016-06-26)