兩株高效耐鹽菌的分離鑒定及生長特性研究

單德鑫　李海統　黃河　等

摘要：從大慶不同利用類型的鹽堿土地區取土樣，經馴化、分離篩選出兩株高效耐鹽菌，分別命名為A和B。經形態特征觀察、生理生化試驗、掃描電鏡觀察和16S rDNA鑒定得知，菌種 A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），均為芽孢桿菌屬。經過單因素試驗，得出A、B的最適生長條件均為溫度30 ℃，pH 7～9，鹽濃度20%，這將為以后該地區微生物資源開發利用提供理論依據。

關鍵詞：鹽堿土；高效耐鹽菌；分離；分子鑒定；生長特性

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5395-03

松嫩平原鹽漬土分布十分廣泛，是我國鹽漬化土壤的最大分布區，其地處半濕潤半干旱區，具有廣泛的閉流區和礦化度很高的無尾河，年降水量約450 mm[1]，該區鹽漬土主要分布在平原西部的半干旱和干旱地區，主要包括吉林西部的松原和白城地區，黑龍江的三肇、安達、大慶和齊齊哈爾等地區[2]。其中大慶的鹽堿化土地面積為13.69×104 hm2，占其土地總面積的28.3%[3]。土壤鹽漬化導致大量土壤資源喪失，農業生產條件惡化，嚴重阻礙了當地農業和農村經濟的持續健康發展。因此本試驗從大慶鹽堿地區取樣，分離篩選耐鹽菌種，對當地鹽堿土中微生物資源狀況進行初步探索，為以后該地區微生物資源開發利用提供理論依據，為研發更加成熟的菌劑提供基礎和依據。

1 材料和方法

1.1 材料

分別從大慶的鹽堿地區的農田、農田秸稈還田結合區、農田休耕結合區、湖邊、堿泡地、石油區取得土樣，具體地點如表1所示。

培養基的組成如下。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 調至7.2～7.4。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調至7.2～7.4。LB培養基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH調至7.2～7.4。所有培養基在121 ℃，0.1 Mpa下滅菌20 min備用[4]。

1.2 菌種的分離純化及篩選

將土壤樣本分為6組，每組各取0.1 g置于100 mL三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，加玻璃珠充分打散，于120 r/min搖床中培養3 d[5]。各取1 mL懸液稀釋濃度至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分別涂布到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養3 d，用劃線法純化培養，然后把已經純化得到的菌種接種到NaCl濃度分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%和32% 的牛肉膏蛋白胨的液體培養基里[6-8]，置30 ℃下培養，觀察生長情況，以確定細菌耐鹽程度[9]。

參考《常見細菌系統鑒定手冊》，通過對菌種進行形態學觀察及相關生理生化試驗，從而對菌種A、B進行初步鑒定[10]，掃描電鏡觀察進一步鑒定。而后進行耐鹽菌的分子鑒定，即提取菌種的DNA，然后采用細菌16S rDNA的通用引物進行PCR擴增。BSF8/27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；BSR

1510/1492：5′-GGTTACCTTCTTACGACTT-3′。

PCR反應體系（50 μL）：5 μL 10 × Buffer，4 μL 2.5 mmol/L dNTP，2 μL BSF8/27 引物（0.1 nmol/μL），2 μL BSR1510/1492引物（0.1 nmol/μL），0.5 μL Taq酶（5 U/μL），1 μL模板DNA，35.5 μL雙蒸水。反應條件如下：

94 ℃ 預變性 5 min

94 ℃ 變性 45 s

55 ℃ 退火 90 s

72 ℃ 延伸 2 min

72 ℃ 延伸 10 min

PCR反應產物的純化以及測序由上海生工完成。16S rDNA同源性比較與系統發育學分析將所測得的序列于Genbank上進行Blast比對，利用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹[11]。

1.3 菌種的生長特性研究

為研究菌種的最適生長條件，進行單因素試驗。

1.3.1 溫度 向液體牛肉膏蛋白胨培養基中接入2 mL菌懸液，分別在15、20、25、30、35、40 ℃條件下培養，均做3個平行試驗，120 r/min振蕩24 h后，測定培養基內菌液OD值。

1.3.2 pH 將菌懸液分別接入pH為3、5、7、9、12的牛肉膏蛋白胨液體培養基內，其他條件同上，測定24 h后培養基內菌液OD值。

1.3.3 鹽濃度 將菌懸液分別接入鹽濃度為10%、15%、20%、25%、30%的牛肉膏蛋白胨液體培養基內，其他條件同上，測定24 h后培養基內菌液OD值。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離純化及篩選

將取樣地樣本進行初篩，共獲得34株菌。再經富集培養、梯度稀釋的菌液涂布于篩選培養基培養，將其純化后轉接到篩選培養基上，30 ℃培養2～5 d。在平板培養基上選取高濃度區域以外分散的單菌落，根據菌落大小、形狀、顏色、隆起程度、表面光澤、透明程度、邊緣形狀和在高鹽濃度下生長情況等差別，最終分離出2株菌落，分別命名為菌種A、B。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種形態特征觀察 菌種A呈米黃色，菌體表面光滑并且濕潤，單一菌落形狀為長圓形，邊緣平滑，在液體培養基生長渾濁，容易被挑起，沒有菌膜形成，無沉淀。菌種B呈乳脂狀，呈現乳白色，透明，單一菌落形狀為圓形，邊緣為鋸齒狀，菌體表面光滑且濕潤，不容易被挑起；在液體培養基生長渾濁，沒有菌膜形成，無沉淀。

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進行葡萄糖氧化產酸，在生長溫度測定試驗中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴散，表示菌種均有運動性。其他結果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對發現該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達到了99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖2。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖3。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時生長狀態良好，pH為3～5時生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時生長情況較好，pH為12時仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強酸的條件不適合菌種的生長，強堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經一系列生理生化試驗鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗可知，菌種A、B最優條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

參考文獻：

[1] 劉興土.松嫩平原退化土地整治與農業發展[M].北京：科學出版社，2001.

[2] 宋長春，何 巖，鄧 偉.松嫩平原鹽漬土壤生態地球化學[M].北京：科學出版社，2003.

[3] 李取生，李秀軍，李曉軍，等.松嫩平原蘇打鹽堿地治理與利用[J].資源科學，2003（1）：17-22.

[4] 周德慶，徐德強.微生物學實驗教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐鹽苯酚降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[D].鎮江：江蘇科技大學，2013.

[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細菌的分離及其生物學特性[J].陜西師范大學學報（自然科學版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優化研究[J].環境科學學報，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程麗娟，薛泉宏.微生物學實驗技術[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學軟件應用[M].北京：北京大學醫學出版社，2007.

（責任編輯 彭西甜）

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進行葡萄糖氧化產酸，在生長溫度測定試驗中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴散，表示菌種均有運動性。其他結果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對發現該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達到了99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖2。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖3。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時生長狀態良好，pH為3～5時生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時生長情況較好，pH為12時仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強酸的條件不適合菌種的生長，強堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經一系列生理生化試驗鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗可知，菌種A、B最優條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

參考文獻：

[1] 劉興土.松嫩平原退化土地整治與農業發展[M].北京：科學出版社，2001.

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[3] 李取生，李秀軍，李曉軍，等.松嫩平原蘇打鹽堿地治理與利用[J].資源科學，2003（1）：17-22.

[4] 周德慶，徐德強.微生物學實驗教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐鹽苯酚降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[D].鎮江：江蘇科技大學，2013.

[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細菌的分離及其生物學特性[J].陜西師范大學學報（自然科學版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優化研究[J].環境科學學報，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程麗娟，薛泉宏.微生物學實驗技術[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學軟件應用[M].北京：北京大學醫學出版社，2007.

（責任編輯 彭西甜）

2.2.2 菌種生理生化鑒定 菌種A、B均能進行葡萄糖氧化產酸，在生長溫度測定試驗中均有渾濁，無沉淀物和懸浮物產生。生長物有穿刺線向四周呈云霧狀擴散，表示菌種均有運動性。其他結果見表2。

2.2.3 掃描電鏡觀察 菌種A和菌種B都是桿狀菌，菌種A和B的掃描電鏡的照片見圖1，照片的放大倍數是10 000倍。菌體大小分別為（1.0～1.5） μm×（0.5～1.0） μm和（0.5～2.0） μm×（0.5～1.5） μm，均無芽孢，無鞭毛。

2.2.4 菌種的分子鑒定 菌種A及菌種B的完整基因序列長度分別是1 452 bp和1 451 bp。將菌種A的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對發現該耐鹽菌的基因序列與Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037同源性達到了99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖2。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌A屬芽孢桿菌屬。

將菌種B的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中的數據比對，該菌基因序列與Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1同源性達99%。根據比對結果建立系統發育樹，見圖3。由分子鑒定結果可知，高效耐鹽菌B屬芽孢桿菌屬。

2.3 菌種的生長特性研究

2.3.1 溫度對菌種生長的影響 由圖4可知，菌種A和B的最適生長溫度均為30 ℃，溫度升高至35 ℃時，菌液的濃度降低，菌種生長十分緩慢。

2.3.2 pH對菌種生長的影響 由圖5可知，菌種A在pH為7～9時生長狀態良好，pH為3～5時生長十分緩慢。菌種B在pH為7～9時生長情況較好，pH為12時仍能生長。綜上所述，菌種A、B的最適pH值范圍為7～9，強酸的條件不適合菌種的生長，強堿性的條件菌種能夠生長。

2.3.3 鹽濃度對菌種生長的影響 由圖6可知，鹽濃度為10%～15%時，菌種A和B生長緩慢，鹽濃度為15%～25%時，菌種A和B生長迅速，鹽濃度為25%～32%時，菌種A和B仍能生長，但生長緩慢，綜上所述，菌種A和B耐鹽范圍比較大，可耐受較高鹽濃度。

3 小結與討論

1）以大慶鹽堿地取得的土壤樣本為菌源，利用采用牛肉膏蛋白胨培養基，稀釋平板法分離純化，最終篩選得到能夠最高耐受鹽濃度32%的菌種A和菌種B。

2）經一系列生理生化試驗鑒定和16S rDNA測序比對，菌種A 為脫氮嗜鹽芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans strain DSM 10037），菌種 B 為咸魚芽孢桿菌（Piscibacillus salipiscarius strain RBU1-1），菌種A和B均屬芽孢桿菌屬。

3）通過單因素試驗可知，菌種A、B最優條件組合均為：溫度30 ℃，pH在7～9，鹽濃度20%。在此條件下，菌種生長最好。

參考文獻：

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[2] 宋長春，何 巖，鄧 偉.松嫩平原鹽漬土壤生態地球化學[M].北京：科學出版社，2003.

[3] 李取生，李秀軍，李曉軍，等.松嫩平原蘇打鹽堿地治理與利用[J].資源科學，2003（1）：17-22.

[4] 周德慶，徐德強.微生物學實驗教程[M].第三版.北京：高等教育出版社，2013.

[5] 姜朵朵.耐鹽苯酚降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[D].鎮江：江蘇科技大學，2013.

[6] 米 琴，張玉琴，陳義光，等.青海鹽環境下革蘭氏陽性中度嗜鹽細菌的分離及其生物學特性[J].陜西師范大學學報（自然科學版），2005，33（3）：86-90.

[7] 韋 娜，張前前，杜宗軍，等.極端嗜鹽菌Halomonas elogata的分離鑒定及其降解偶氮染料活性蘭BRF的條件優化研究[J].環境科學學報，2012，32（9）：2091-2096.

[8] 程麗娟，薛泉宏.微生物學實驗技術[M].西安：世界圖書出版公司，2000.

[9] YOICHI K， MAKOTO O， TAKANORI I， et al. Varietal and seasonal differences in oxalate content of spinach [J]. Scientia Horticulturae，2003，97：203-210.

[10] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11] 劉旭光，張 杰.分子生物學軟件應用[M].北京：北京大學醫學出版社，2007.

（責任編輯 彭西甜）