一體式微弱熒光檢測器的研究與設計*

姚定勇，蔡　強*，沈國金，王振華

（1.杭州電子科技大學電子信息學院，杭州310018；2.浙江清華長三角研究院，浙江嘉興314006）

一體式微弱熒光檢測器的研究與設計*

姚定勇1，2，蔡強1，2*，沈國金2，王振華2

（1.杭州電子科技大學電子信息學院，杭州310018；2.浙江清華長三角研究院，浙江嘉興314006）

設計完成了一體式微弱熒光檢測器，該檢測器可以檢測經激發光照射后熒光染料、綠色熒光蛋白等物質發出的微弱熒光信號，由此測得熒光素、綠色熒光蛋白等物質的含量。檢測器由光源模塊、PN放大模塊、采樣控制模塊和通訊模塊組成。應用測試結果表明該檢測器能檢測1 000個光子的微弱熒光強度變化，精度上可檢測3.0 pmol的熒光素，滿足一般的微弱熒光檢測需求。

光電檢測；一體式；熒光分析；跨阻放大電路；積分放大電路

熒光分析是定性或定量分析物質特性的重要方法，具有靈敏度高，信號穩定等優點［1］。熒光分析法能夠提供熒光強度、熒光效率以及熒光壽命等重要參數信息［2］，廣泛應用于工業分析、環境保護、醫藥、生物等領域。對于很多樣本量或樣本體積較小的情況下，熒光強度較低，因此微弱熒光檢測具有重要意義。

微弱熒光檢測主要采用光電二極管或光電倍增管作為探測器。微弱熒光的檢測方法有兩類，一類是直接檢測法，另一類是基于互相關等數學原理的檢測法，如鎖相放大器［3］，取樣積分器［4］。直接檢測法原理簡單，信噪比相對低，不受信號類型限制，容易調試，是目前最常用的微弱熒光檢測法；而鎖相放大器和取樣積分器，輸出信噪比高，會受信號類型限制，鎖相放大器適用于單頻和窄帶弱信號檢測，而取樣積分器適合檢測復雜的寬帶周期信號，且難以調試。目前，商用的熒光檢測器有島津ShimadzuRF-20A，沃特斯2475等，這些熒光檢測器通常結構復雜，體積較大，不適合緊湊的儀器結構設計。因此，本文設計一體式微弱熒光檢測器模塊，為使模塊體積小，且易于調試，采用LED作為激發光源，使用直接檢測法，利用光電二極管結合放大、濾波等電路檢測微弱熒光信號，具有體積小，易于集成，適用范圍廣的特點。

1　整體結構設計

本文設計的熒光檢測器是光學分析儀器的組成部分，因此要求該檢測器需具備模塊化，可集成，可控制，輸出數字信號的特點。考慮到光學分析儀器典型應用領域，如生物樣品測定［5］等。本文設計的一體式微弱熒光檢測器要求精度達到3.0 pmol的熒光素，檢測波長范圍為400 nm～750 nm，包括光路結構和電路結構兩部分。

1.1光路結構

檢測器光路結構如圖1所示。由光源模塊輸出的激發光入射到樣品孔后，激發熒光信號進入熒光檢測光路中，檢測光路分為激發光路和發射光路兩部分。激發光路是將光源發射的單色光照射到樣品上，實現熒光激發。檢測光路采用濾光片組加光電二極管的方案，其中濾光片組用于選擇不同的激發波長，而光電二極管能檢測微弱熒光信號的同時利用其體積小的特點，可縮短光路尺寸大小［5］，本設計選用濱松的S2387-66R型光電二極管。為了適應不同場合的需求，光路結構設計成插件形式，需根據檢測樣本的激發波長和發射波長選擇合適的LED和濾光片組，實物如圖2。以實驗中檢測熒光染料Cy3為例，激發波長為525 nm，熒光發射波長為590 nm。光源選用Thorlabs公司的LED525E型LED（規格：T 1-3/4），激發濾光片和發射濾光片分別為匯博光學的EF525-45（規格：D12×2 mm）和EF595-60（規格：D12×6 mm）型濾光片，二向色鏡為匯博光學DM560（規格：16×15×1 mm）型色鏡。

圖1　光路結構圖

圖2　熒光檢測器實物照片

1.2電路結構

檢測器采用低噪聲前置放大電路調理光電二極管輸出的光電流，隔離信號源與后級放大電路之間的耦合作用［6］。采用二級放大和濾波電路提高信號強度，抑制噪聲。考慮到微弱熒光的激發光源易受溫度等外界因素干擾，因此本文采用反饋型光源驅動電路，用光電二極管配合低噪聲光電檢測電路和信號調理電路，反饋控制光源驅動電流的的檢測。實現激發光強的穩定。電路結構組成如圖3所示。

圖3　電路結構圖

2　檢測電路設計

本文在檢測電路上采用了兩種方案：跨阻型檢測和積分型檢測。其中跨阻型放大器的檢測方案不受積分時間限制，因而檢測速度快，但靈敏度稍低，適用于檢測速度快，但靈敏度要求不高的場合；積分型因積分特性可以靈活控制檢測器的靈敏度，但不適合用在檢測速度要求高的場合。

2.1跨阻式檢測電路

2.1.1光電轉換電路

本設計使用日本濱松的S2387-66R型硅光電二極管作為探測器。用光電二極管組成的光電檢測電路，實際上是一個光→電流→電壓的變換器［7］。S2387-66R型光電二極管的靈敏度在光波長為560 nm時典型值為0.33 A/W，暗電流最大50 pA，可以檢測nW級微光功率。考慮到在微弱光強信號測量中，暗電流帶來的噪聲非常明顯［8］，本設計采用零偏置工作的光伏模式，應用于頻率不高的微弱光信號檢測［9，10］，電路如圖4所示。根據電路，輸出電壓為：

式中：S為光電二極管的靈敏度，P為入射光功率，入射光功率為nW量級甚至更低，Rf為數百kΩ到數十MΩ，輸出電壓Vo為幾mV到幾十mV。本設計為盡可能提取微弱熒光信號，反饋電阻大小選擇10 MΩ。電路中Cf用于防止電路自激振蕩，以保證電路能夠工作在良好的線性條件下［11］。

圖4　光電轉換電路

在微弱光信號檢測電路中，輸入光功率一般在0到幾十nW之間，根據所選光電池的靈敏度，輸出電流最多只有幾十nA。本設計選擇AD8667做為前級放大電路的運放，其典型的輸入偏置電流為0.3 pA，輸入失調電壓為30 μV，該運放輸入偏置電流比輸入信號小4個數量級，可以達到較好的信噪比［11］。放大器的輸入失調電壓是微伏級，低于目標輸出電壓3個數量級，滿足使用要求。

圖5為光電二極管等效電路，輸入偏置電流Is經I/V轉換后得到的輸出為IB·Rf，輸入失調電壓經運放后輸出為（1+Rf/Rs）/VB。AD8667的典型輸入偏置電流0.3 pA，輸入失調電壓為30 μV，光電二極管的并聯電阻 Rs典型值為 10 GΩ，反饋電阻Rf為 10 MΩ，因而，輸入偏置電流和輸入失調電壓對輸出電壓的影響為幾十μV，當輸入光功率在nW級的時候，這種影響可以忽略不計。

圖5　光電二極管等效電路

2.1.2濾波電路

為了提高電路的信噪比，本設計在光電轉換電路后加入二階有源低通濾波器［12］，以濾除有用信號頻帶外的噪聲。光電二極管經光電轉換后得到的是直流信號，噪聲主要來源于開關電源。因此，這里只要用低通濾波器濾除開關電源中引入的噪聲信號即可，放大器選用AD8667。

濾波電路如圖6所示，傳遞函數

由于實驗中使用的開關頻率為100 kHz，為有效濾除開關噪聲，設置濾波器截止頻率為1 kHz，令R8=R9=15 kΩ，C16=C17=10 nF，得fH=1.061 kHz。

圖6　濾波電路

2.1.3放大電路

一級放大電路難以實現對微弱信號的放大，再加上放大器本身增益有限，而且信號還淹沒在噪聲中，輸入信噪比非常低，所以須采用多級放大電路來實現信號的放大處理［13］。電路如圖7所示，采用二級放大電路，二級放大電路與后端AD轉換電路結合可以實現簡單的程控放大。利用AD轉換芯片對兩級放大的輸出分別采樣，根據信號幅度取舍信號。這種方式不僅能夠實現程控放大，還可以簡化電路結構。本設計采用OP2177作為主放大電路的放大器，其中

圖7　主放大電路

2.2積分式檢測電路

本設計使用TI公司的IVC102積分放大電路進行微弱光功率的測量，電路如圖8所示。

圖8IVC102積分電路

IVC102是一種采用積分方式的放大器，內部集成了100 pF的積分電容。具有積分時間可調，噪聲低，響應速度快的幾大特點。IVC102的積分輸出為：

其中CINT是積分電容，積分電路的輸出實際只與IIN（t）有關。IIN（t）=IS（t）+IN（t），IS（t）光電池產生的電流；IN（t）為噪聲電流，主要來源是放大器的輸入偏置電流以及輸入噪聲電流。光電二極管產生的信號是直流信號，由此可以得到

式中，TINT為積分時間，從公式可知，積分輸出的趨勢呈線性，積分的結果是以犧牲時間為代價換取檢測靈敏度。IVC102對于輸入信號頻率大于1/TINT的頻率響應為-20 dB/dec。因此，對于高頻信號而言不適合采用該芯片，而本設計的光電二級光輸出為直流信號，故適合使用。為增加檢測范圍，采取分段積分的方法，信號較弱時，設置積分時間200 ms，信號較強時，設置積分時間為20 ms。

3　光源驅動電路設計

在光電檢測電路中，除系統本身產生的噪聲，包括光電檢測器件以及檢測電路的固有噪聲會影響檢測結果的穩定性，外部噪聲包括光輻射源的隨機波動和附加的光調制、光路傳輸介質的湍流和背景起伏、雜散光的入射以及檢測系統所受到的電磁干擾等也會影響檢測結果的穩定性［14］。因此，本設計除通過遮光和加濾光片來減小外部噪聲，還增加了一個帶光強反饋的驅動電路，穩定輻射光源功率，減小外部噪聲干擾。

光源驅動電路采用ADI公司的ADN2830集成電路構成，電路如圖9所示。ADN2830是帶有光強反饋功能的光源驅動器。輸出電流范圍在4 mA到200 mA。使用時需要外接反饋光電二極管，控制回路通過調節驅動發光二極管的電流大小來保持反饋光電二極管的恒定電流，從而使得發光二極管的光功率恒定。光功率的大小在硬件電路上調節。支持可編程報警機制，可軟件控制光源驅動器。并提供兩種驅動模式：恒定光功率模式和恒流源模式。恒流源模式可使發光二極管電流恒定，但無法保證光源的穩定，因此這里采用恒定光功率的模式。

圖9　光源驅動電路

4　信號采集電路設計

為直觀讀取微弱光檢測電路的輸出結果，需要經過數據的采集和顯示環節［15］。信號采集電路采用TI公司的ADS1254芯片，它是24 bit高精度串行模數轉換器，運用逐次逼近的原理，四通道輸入，模擬電壓的輸入范圍為±10 V，采樣速率可通過外部時鐘調節，最大采樣頻率20 kHz，采用SPI通信方式。采樣電路示意圖如圖10所示，利用STM32作為數據采集與傳輸核心，MAX3232是數據傳輸的橋梁。采樣頻率由CLK決定，本設計采用STM32輸出2 M的PWM波作為采樣時鐘，采樣速率5 kHz，輸出24 bitAD數據。STM32單片機接收采樣指令后進行采樣，然后以指令形式返回采樣結果。

圖10　信號采集電路示意圖

5　通信協議設計

通信協議設計是基于Modbus-RTU協議的下發指令和上傳數據，數據通信采用主從查詢模式，數據校驗使用Modbus CRC校驗。本設計使用Modbus協議中的03功能，即讀單個或多路寄存器。接收、發送指令的格式與具體指令如表1所示。

表1　通信協議格式

6　應用測試

為測試一體式熒光檢測器，本文以生物熒光分析領域的典型應用為背景，建立測試方法，優化設計方案。測試方法采用熒光染料Cy3，采用標準緩沖液稀釋法配置不同濃度待測溶液，用Thorlabs公司的LED525E型中心波長為525 nm的LED激發熒光染料。并用單光子計數器的測試結果作為標準參照。圖11是測試裝置。測試方法是將微弱光檢測模塊掛載在托盤上方，將待測樣品加在96孔微孔板中，通過主控板控制步進電機的精準走位，使檢測模塊的激發光對準樣品孔，熒光染料經激發后發射微弱熒光信號被位于孔正上方的檢測器檢測，再被主控板讀取并傳送至上位機顯示。檢測時裝置外殼是完全封閉的，避免受外界光干擾。

圖11　測試裝置

測試數據如表2所示，分別列出了單光子計數器的檢測結果和熒光檢測器的檢測結果，表中給出了熒光染料中熒光素的含量，以光子的變化量作為光強變化的依據，與檢測結果做對比。

表2　一體式熒光檢測器檢測結果

從前述方案設計和檢測結果可以看出：（1）兩種方案的檢測器精度均可以達到3.0 pmol的熒光素，可以滿足一般微弱熒光的檢測。通過對樣本的重復測試得出兩種方法隨機誤差均小于8%，積分型檢測器的檢出限為2.9 pmol熒光素，線性度為99.02%；跨阻型檢測器的檢出限為12.7 pmol熒光素，線性度為99.5%，積分型和跨阻型檢測器測量范圍均不超過6.0 nmol熒光素。（2）積分型檢測器的靈敏度更高，但犧牲了檢測時間。（3）積分型檢測器電路結構簡單，但采用IVC102作為積分器其頻率特性使其只適合檢測低頻微弱熒光信號；跨阻型檢測器電路復雜，但可通過調整濾波器頻率滿足多數微弱熒光信號的檢測需求。

7　結論

本文依據市場上現有熒光檢測器的不足，結合微弱熒光檢測的需求，設了一體式微弱熒光檢測器。并根據檢測速度和靈敏度要求的不同，給出了兩種方案，實驗結果表明兩種方案均可用于檢測熒光分析法中的微弱熒光信號。其模塊化的特點也為相關儀器的集成提供了極大的方便。

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姚定勇（1991-），男，漢族，安徽六安人，杭州電子科技大學在讀碩士研究生，主要研究方向為環境檢測儀器技術，嵌入式系統，479334246@qq.com；

蔡強（1972-），男，漢族，安徽蚌埠人，浙江清華長三角研究院分析測試中心研究員，主要研究方向為環境檢測儀器技術研究，caiq@tsinghua.edu.cn。

Research and Design of the Integrated Detector for Weak Fluorescence Signal*

YAO Dingyong1，2，CAI Qiang1，2*，SHEN Guojin2，WANG Zhenhua2
（1.Electronic Information Institution of Hangzhou Dianzi University，Hangzhou 310018，China；2.Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University，Jiaxing Zhejiang 314006，China）

A integrated detector is designed and accomplished for weak fluorescence signals，aiming at the detection of the fluorescence intensity emitted by Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be used to measure the concentration of the Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be made up of several modules，which are the source of light，the amplifier of PN，sampling control unit and the communication unit.Application of the test results show that the detector can detect weak fluorescence intensity of 1 000 photons change，3.0 pmol Fluorescein.It can be used for general needs of weak fluorescence detection. Key words:photoelectric detection；integrated；fluorescence analysis；conventional transimpedance amplifier；integrating transimpedance amplifier

TP211.6

A

1005-9490（2016）05-1129-06

項目來源：國家重大科學儀器設備開發專項目（2012YQ15008705）；浙江省科技計劃項目（2014F10059）

2015-10-10修改日期：2015-10-27

EEACC:425010.3969/j.issn.1005-9490.2016.05.022