紅曲菌發酵豆漿生產Monacolin K的研究

馬帥，邵穎，談文詩，陳濤

（華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070）

紅曲菌發酵豆漿生產Monacolin K的研究

馬帥，邵穎，談文詩，陳濤*

（華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070）

以豆漿為原料，以紅曲菌Monascuspilosus MS-1為菌種生產Monacolin K，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化紅曲菌生產Monacolin K液態發酵條件。結果表明，紅曲菌發酵豆漿生產Monacolin K的優化條件為甘油濃度30 g/L，初始pH 6.0，接種量7%，在此條件下，發酵10 d后Monacolin K產量達到415.15 mg/L。方差分析表明，甘油對MonacolinK產量有極顯著的影響，初始pH有顯著影響，接種量無顯著影響。

紅曲菌；豆漿；Monacolin K；條件優化

紅曲是經紅曲菌發酵而成的一種藥食兼用的紫紅色米曲［1］。紅曲菌是一種小型腐生真菌，在我國已有上千年的使用歷史，紅曲菌發酵能產生多種具有生理活性的次生代謝產物，主要有紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）［2］。

Monacolin K最早是于1979年由日本學者遠騰章教授在紅色紅曲菌中發現的［3］，其對羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶（催化膽固醇合成中的限速步驟）具有強的競爭性抑制作用，從而有效地、特異性地抑制膽固醇的合成。這類物質濃度達到0.001 μg/mL～0.005 μg/mL時就能抑制膽固醇的合成，已經在國內外開發了多種Monacolin K藥物制品，是國際公認的理想的降膽固醇和血脂藥物。另外，Monacolin K還具有抗動脈粥樣硬化、抑制皮冠狀動脈腔內成形術后再狹窄、保護心肌細胞和內皮細胞、抗炎和抗癌等作用［4-8］。

大豆含有豐富而優質的蛋白質、多種不飽和脂肪酸，且氨基酸種類齊全，含有人體所需的8種必需氨基酸且含量滿足人體需求，是一種健康食品［9-10］。國內外研究表明，大豆蛋白具有降低高膽固醇血癥患者膽固醇水平的潛在功能，且大豆蛋白本身含有的一些其他組分，如大豆異黃酮和大豆磷脂都證明具有一定的降血脂功效［11-12］。

以大豆為原料制作豆漿，然后以豆漿為培養基接種紅曲菌生產Monacolin K，通過液態發酵優化紅曲菌產Monacolin K的工藝參數，以提高產品中MonacolinK的產量。得到的紅曲豆漿既有豐富的營養成分，又有Monacolin K的保健功能，還可能起到大豆蛋白和Monacolin K的協同降低膽固醇作用。試驗使用的菌種Monascus pilosus MS-1經分析鑒定不產桔霉素［13］，使用豆漿和食品級試劑作為培養基成分，生產的紅曲豆漿可以直接作為功能性食品或原料用于食品及醫藥領域，避免了有機溶劑提取等復雜步驟，符合綠色環保的要求，具有一定的應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

Monascus pilosus MS-1：華中農業大學食品生物技術與安全實驗室保藏菌種。

1.1.2培養基

菌種活化培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至1000mL，pH自然）。

種子培養基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NH4H2PO42 g，CaCl20.1 g，定容至1 000 mL，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基：大豆浸泡12 h，磨漿，調整豆水比（g/ mL）為1∶9，12層紗布過濾2次，取濾液，按比例加入碳源，調節至適宜pH，制成豆乳原液，121℃滅菌20 min。

1.1.3試劑

洛伐他汀（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；甘油（食品級）：豐益油脂化學（上海）有限公司；無水乙醇、磷酸、甲醇，均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：上海珂淮試劑有限公司；飲用純凈水。

1.2儀器與設備

LC-20A型島津高效液相色譜儀：日本島津公司；Neofuge-18R型臺式高速冷凍離心機：力康發展有限公司；KQ2200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HZ200L型恒溫搖床：武漢瑞華儀器設備有限責任公司。

1.3方法

1.3.1紅曲豆漿生產主要工藝

大豆挑選→浸泡（豆水比1∶3（g/mL））→磨漿［豆水比1∶9（g/mL）］→過濾→豆漿→加碳源→滅菌→接種紅曲菌→搖瓶發酵→Monacolin K分析

1.3.2菌種活化

PDA斜面培養基活化紅曲菌，30℃恒溫培養室內培養11 d后備用。

1.3.3種子培養

將活化好的斜面刮至裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中，打散。500 mL三角瓶裝100 mL培養基，5%接種量，30℃，150 r/min恒溫搖床培養36 h。

1.3.4分批培養

將種子液接入發酵培養基中，250 mL三角瓶裝50 mL發酵培養基，發酵培養數天后提取發酵液中的Monacolin K。

1.3.5單因素試驗

以碳源種類、碳源濃度、初始pH、接種量進行單因素試驗，每個水平重復3次，取平均值，分析各單因素對Monacolin K產生的影響。

1.3.5.1碳源對Monacolin K的影響

以豆漿培養基為基礎，測定碳源（濃度20 g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖）對Monacolin K的影響，設置空白對照組，接種量5%，初始pH 5.0，25℃，150 r/min恒溫搖床培養10 d。

1.3.5.2接種量對Monacolin K的影響

以豆漿培養基為基礎，加入甘油使濃度為20 g/L，測定不同接種量（4%、5%、6%、7%、8%）對Monacolin K的影響，初始pH 5.0，25℃，150 r/min恒溫搖床培養10 d。

1.3.5.3初始pH對Monacolin K的影響

以豆漿培養基為基礎，加入甘油使濃度為20 g/L，測定不同初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對Monacolin K的影響，接種量7%，25℃，150 r/min恒溫搖床培養10 d。

1.3.5.4甘油濃度對Monacolin K的影響

以豆漿培養基為基礎，測定甘油濃度（0、5、10、20、30、40 g/L）對Monacolin K的影響，接種量7%，初始pH5.5，25℃，150 r/min恒溫搖床培養10 d。

1.3.6正交試驗

根據單因素試驗結果，選定甘油濃度（A）、初始pH（B）、接種量（C）這3個因素，采用L9（34）正交表設計正交試驗，以Monacolon K的產量選定最優方案，每個試驗重復3次，取平均值。試驗因素及水平如表1。

表1　正交試驗因素水平設置Table 1　Arrangement of factors and levels in inorthogonal test

1.3.7發酵液中Monacolin K的測定［7］

樣品提取：發酵液過濾除去菌絲，以V（濾液）∶V（無水乙醇）=1∶3的比例向濾液中加入無水乙醇，混勻后靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm膜后用HPLC分析。

HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB C-18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；紫外檢測器波長：238 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。柱溫：30℃；流動相：V（乙腈）∶V（純凈水）∶V（0.5%磷酸水溶液）=60∶37∶3。

1.3.8數據處理

每個試驗處理進行3次重復，取其平均值進行相關分析。利用數學分析軟件SAS V8和Microsoft Excel. 2010進行統計分析。

2　結果與分析

2.1不同單因素對紅曲菌生產Monacolin K的影響

2.1.1不同碳源對紅曲菌生產Monacolin K的影響

碳源是微生物生長重要的營養物質之一，是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發育必需的能源物質。碳源單因素試驗結果見圖1。

圖1　不同碳源對紅曲菌生產Monacolin K的影響Fig.1　Effect of different carbon source on the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

如圖1所示，在5種碳源中，麥芽糖和葡萄糖作為碳源時Monacolin K的產量較低。甘油作為碳源時Monacolin K產量較高，這與相關文獻研究報道結果一致［14-15］。以甘油為碳源時MonacolinK產量為295.8mg/L，高于其它種類的碳源，故選甘油為紅曲菌發酵的碳源。

2.1.2不同接種量對紅曲菌生產Monacolin K的影響

接種量單因素試驗結果如圖2所示。

當接種量較少時，Monacolin K產量較低，可能是因為低的接種量時培養基中營養物質相對豐富，利于菌體生長而使Monacolin K的合成減少。接種量過大，菌體繁殖過快，對Monacolin K的產生有一定阻遏作用。接種量為7%時，對應Monacolin K產量為231.6 mg/L，高于其它接種量，故選7%為最適接種量。

圖2　不同接種量對紅曲菌生產Monacolin K的影響Fig.2　Effect of different inoculum size on the the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

2.1.3初始pH對紅曲菌菌生產Monacolin K的影響

發酵環境的pH對微生物的生長有重要的影響，pH可改變微生物細胞膜的通透性和細胞代謝所需的酶的活性，從而影響代謝產物的合成積累。初始pH單因素試驗結果見圖3。

圖3　初始pH對紅曲菌生產Monacolin K的影響Fig.3　Effect of the original pH on the the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

如圖3所示，當初始pH在4.5以下時，Monacolin K的產量較低。當初始pH為5.5時，對應Monacolin K的產量最高為276.8 mg/L。pH升高或降低時，Monacolin K的產量都降低。故最適pH為5.5。

2.1.4不同甘油濃度對紅曲菌生產MonacolinK的影響甘油單因素試驗結果見圖4。

圖4　甘油濃度對Monacolin K產生的影響Fig.4　Effect of the concentration of glycerol on Monascus producing Monacolin K

由圖4可以看出，培養基中加入適量甘油可極大的提高Monacolin K的產量，但是較高濃度的甘油又使其產量降低，當甘油濃度為20 g/L時，對應Monacolin K的產量較高，為215.04 mg/L，故甘油濃度選擇20 g/L。

2.2正交試驗

綜合單因素試驗確定的初步結果，應用L9（34）正交表設計正交試驗，選定接種量、初始pH、甘油濃度3個因素，每個因素取3個水平，分別以1、2、3編碼，以Monacolin K產量確定最優方案，進行三因素三水平試驗，共設立9個處理組，每組重復3次。正交試驗方案及結果分析見表2。

表2　L9（34）正交試驗結果及分析表Table 2　The design of L9（34）orthogonal test

由K值得出最優方案為A3B3C1，在此條件下Monacolin K的產量為406.24 mg/L，低于9號試驗結果，因此采用9號試驗A3B3C2作為較優方案，即甘油濃度30 g/L、初始pH 6.0、接種量7%，在此條件下Monacolin K的產量達到415.15 mg/L。

正交試驗方差分析見表3。

由此可以得出，各因素對紅曲菌生產Monacolin K的影響大小順序是A（甘油濃度）>B（初始pH）>C（接種量），其中甘油濃度對對結果有極顯著影響，這與FENG等的研究結果一致［13］，初始pH對結果有顯著性影響，接種量對結果影響不顯著。

3　結論

Monacolin K是一種可抑制體內膽固醇合成的活性物質，紅曲菌Monascus pilosus MS-1在一定條件下能合成Monacolin K且不產桔霉素［13］。本試驗用Monascus pilosus MS-1發酵豆漿生產Monacolin K。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗對紅曲菌生產Monacolin K液態發酵條件進行優化，得到的發酵條件為甘油濃度30 g/L，初始pH6.0，接種量7%，在此條件下發酵10 d后Monacolin K的產量達到415.15 mg/L。本試驗制作的紅曲豆漿既含有大豆豐富的營養成分，又有Monacolin K的保健功能，在食品及醫藥領域有一定的應用前景。下一步將進行動物實驗研究紅曲豆漿的降低膽固醇效果，為紅曲豆漿的實際應用提供數據支持。

Monacolin K作為一種次級代謝產物，其合成受到許多因素的影響。許多不可控因素的變化抑制了Monacolin K的前體物向酸式和內酯式Monacolin K的轉化［16-17］。FENG等在研究中也發現，發酵液中Monacolin K的同系物含量比酸式和內酯式Monacolin K的含量高［13］。在本試驗中，菌種Monascus pilosus MS-1的發酵能力比較不穩定，不同批次之間Monacolin K的產量有一定差異。分析原因可能有：一是原始菌株經過多次傳代之后菌種不穩定；二是MK作為次級代謝產物，對環境條件較敏感，環境中許多不可控因素的變化可能會影響Monacolin K的前體物向酸式和內酯式Monacolin K的轉化。對于如何控制發酵參數，使Monacolin K前體物盡可能轉化成酸式和內酯式Monacolin K，還需要進一步的研究。

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Research of Monacolin K Production by Monascus pilosus MS-1 with Soybean Milk as Fermentation Culture Medium

MA Shuai，SHAO Ying，TAN Wen-shi，CHEN Tao*
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

Monascus pilosus MS-1 was used as original strain to produce Monacolin K by liquid state fermentation with soybean milk as basal culture medium.The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation conditions of Monacolin K.Using Monacolin K content as index，the results indicated that the optimized fermentation conditions were the concentration of glycerol at 30 g/L，the initial pH at 6.0 and the inoculum size at 7%，Under these conditions，the yield of Monacolin K was up to 415.15 mg/L after 10 days of fermentation.The analysis of variance showed that the concentration of glycerol had highly significant influence on the yield of Monacolin K，and the initial pH had significant influence，but the amount of inoculation had no significant influence.

Monascus；soybeanmilk；MonacolinK；conditionoptimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.036

華中農業大學大學生科技創新基金（2014152）

馬帥（1995—），女（漢），在讀本科生，食品質量與安全專業。

陳濤（1979—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品發酵工程。

2015-12-21