MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞跨內皮遷移的研究

皮新苗，李澤宇，馬怡然，李東文

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院2013級，沈陽 110847；2.中國醫科大學附屬第一醫院輸血科，沈陽 110001；3.中國人民解放軍第四六三醫院干部病房，沈陽 110042）

·論著·

MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞跨內皮遷移的研究

皮新苗1，3，李澤宇2，馬怡然2，李東文3

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院2013級，沈陽 110847；2.中國醫科大學附屬第一醫院輸血科，沈陽 110001；3.中國人民解放軍第四六三醫院干部病房，沈陽 110042）

目的 檢測肺癌腦轉移患者和健康人細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK細胞）表達MIP-1α的能力，探究MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞在人腦微血管內皮細胞（HBMEC）中跨內皮遷移作用。方法 培養CIK細胞及HBMEC，RNA干擾和siRNA轉染MIP-1α入CIK細胞，通過跨內皮遷移試驗和細胞黏附試驗，檢測MIP-1α的表達，觀察轉染MIP-1α的CIK細胞穿過血腦屏障能力。結果 MIP-1α在肺癌腦轉移患者的CIK細胞中高表達，能誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞在HBMEC構建的血腦屏障模型中跨內皮細胞遷移。結論 本研究為CIK細胞穿透血腦屏障機制的初步探索，為干預CIK細胞免疫治療肺癌腦轉移瘤提供了新的靶點。

CIK細胞；肺癌；人腦微血管上皮細胞

過繼性免疫治療（adoptive cellular immunotherapy，ACI）是腫瘤免疫治療的重要手段之一，目前已成為腫瘤治療研究中一個新的熱點［1，2］。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer cell，CIK細胞）免疫治療是新一代腫瘤ACI方法。CIK細胞免疫治療通過采集人體外周血T淋巴細胞，經體外擴增后再回輸腫瘤患者體內，在治療各種惡性腫瘤方面有著相當廣闊的前景，一般認為中樞神經系統由于血腦屏障的存在而具有免疫豁免性，因而關于CIK細胞治療肺癌腦轉移瘤的實驗和臨床報道較少。研究［3，4］表明，一些趨化因子如MIP-1α和MCP-1α，在某些病理情況下與T細胞跨內皮轉運有關。在成人T淋巴細胞白血病初期，T淋巴細胞也能分泌MIP-1α［5］。而且，之前的研究［3］也表明，阿爾茨海默病患者的外周T淋巴細胞中MIP-1α會過度表達，它能輔助T淋巴細胞遷移入腦。然而DC-CIK細胞穿透血腦屏障的機制尚不明確，所以本研究提出一個假設：MIP-1α可能是肺癌腦轉移患者外周血CIK細胞進入中樞神經系統的影響因素。本研究檢測了肺癌腦轉移患者和健康人CIK細胞表達MIP-1α的能力，并對MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞在人腦微血管內皮細胞（human brain microvessel endothelial cell，HBMEC）模型中的透過率、遷移能力和細胞黏附力進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

CIK細胞來自中國醫科大學附屬第一醫院招募的志愿者，已簽署知情同意書，并獲得醫院醫學倫理委員會同意，HBMEC由中國醫科大學細胞生物學實驗室提供。10%小牛血清（美國Hyclone公司），RPMI1640培養液（美國Invitrogen公司），MIP-1α siRNA（美國Santa Cruz公司），RNase-free DNaseⅠ（日本TaKaRa生物公司），AMV逆轉錄酶（美國Promega公司），pGEM T載體（美國Promega公司），熒光染料CM-Dil（Invitrogen公司），Nucleofector轉錄系統（德國Amaxa公司），Millicell-ERS系統（美國World Precision Instruments公司），PE5700RT-PCR系統（美國Perkin Elmer公司），Transwell（美國Corning Costar公司）。

1.2 方法

1.2.1 CIK細胞及HBMEC培養：分別采集肺癌腦轉移患者和健康人外周血，淋巴細胞分離液分離、密度梯度離心獲得外周血單個核細胞，于含10%小牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃，5%CO2培養箱中培養4 h，收集未貼壁細胞，調整細胞濃度至4× 106/mL，加入IFN-γ（1 000 U/mL），24 h后加入CD3單抗（50 μg/mL）、IL-2（300 U/mL）、IL-1α（100 U/mL），以后每2 d更換新鮮培養基，并補加IL-2（300 U/mL），培養至14 d左右，收獲CIK細胞。HBMEC加入含10%小牛血清的RPMI 1640營養液，10%Nuserum，2 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸鈉，非必需氨基酸，MEM維生素，在37℃，5%CO2，95%濕度的細胞培養箱中培養。每2 d更換新鮮培養液，待細胞在培養瓶底面生長至90%左右，用含0.25%胰蛋白酶細胞消化液消化細胞，再加入培養液，吹打成單細胞懸液后，1∶4傳代于新的培養瓶中。

1.2.2 RNA干擾和siRNA轉染CIK細胞：MIP-1α siRNA一般由3～5個針對目的基因設計使其表達的19～25個核苷酸片段組成。將MIP-1α siRNA利用Nucleofector系統分別電轉染到肺癌腦轉移患者和健康人CIK細胞，試劑盒設定在D32程序（295 V，1 180 μF和5 000 Ω），一般24 h內完成轉染，大約70%的細胞能成功轉染。

1.2.3 實時PCR：總RNA經RNase-free DNaseⅠ處理，加入AMV逆轉錄酶進行逆轉錄，實時PCR在PE5700RT-PCR系統中執行，MIP-1α擴增條件為94℃2 min，然后94℃15 s，58℃1 min，40個循環；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）擴增條件為95℃15 s，64℃1 min，40個循環；標準曲線用含有MIP-1α pGEM T載體或GAPDH cDNA構建。目標mRNA的起始拷貝數通過標準曲線進行計算。引物和探針見表1。

表1 MIP-1α實時PCR引物和探針Tab.1 MIP-1α primer and probe for real-time PCR

1.2.4 體外血腦屏障模型的建立和內皮滲透性試驗：在24孔3 μm孔徑的Transwell小室上建立血腦屏障模型，Transwell上室以2×105密度接種HBMEC，將24孔板放于37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養4～5 d，Millicell-ERS系統（購自美國World Precision Instruments公司）檢測跨內皮電阻，當跨膜電阻TEER值＞200 Ω·cm-2時，將小室以無血清RPMI1640培養液洗2次，在上室加入0.5 μmol/L被RPMI1640培養液溶解的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），2 h后收集下室培養液，用分光光度計在吸收光為492 nm波長處檢測HRP濃度，當下室沒有HRP時，此模型可以進行跨內皮遷移實驗。

1.2.5 肺癌腦轉移患者CIK細胞跨內皮遷移試驗：將肺癌腦轉移患者CIK細胞（2×105）加入Transwell上室作用20 h，后收集Transwell下室細胞，用細胞計數儀計數細胞穿過率。MIP-1α siRNA處理的肺癌腦轉移患者CIK細胞（2×105）加入Transwell上室作用20 h，后收集Transwell下室細胞，用細胞計數儀計數細胞穿過率。

1.2.6 肺癌腦轉移患者CIK細胞黏附實驗：將HBMEC細胞（2×105）接種于Transwell上，當跨內皮電阻達到200 Ω/cm2以上時，分別將熒光染料CM-Dil標記的肺癌腦轉移患者CIK細胞（2×105）、經MIP-1α siRNA處理的肺癌腦轉移患者CIK細胞加入上室，在1、2、3、4 h進行測試，用RPMI1640培養液輕柔地洗去未黏附于HBMEC表面的CIK細胞，然后將Transwell膜取出并固定細胞，于熒光顯微鏡下200倍放大，計數10個隨機視野中的CIK細胞。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肺癌腦轉移患者CIK細胞表達MIP-1α的能力

對肺癌腦轉移患者和健康人CIK細胞表達MIP-1α的能力進行分析，肺癌腦轉移患者CIK細胞表達MIP-1α的能力高于健康人CIK細胞（圖1）。

2.2 MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞的跨內皮遷移

圖1 實時RT-PCR檢肺癌腦轉移患者和健康人CIK細胞表達MIP-1α水平Fig.1 MIP-1αmRNA expression level in CIK cells of lung cancer patients with brain metastasis and healthy individuals RT-PCR

肺癌腦轉移患者CIK細胞被MIP-1α siRNA轉染后，實時PCR檢測顯示MIP-1α siRNA組MIP-1α/ GAPDH比值明顯低于對照組（圖2A，P＜0.05）。MIP-1αsiRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞和未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞分別與HBMEC作用20 h后，對穿過HBMEC的細胞數計算表明，MIP-1α siRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞的跨內皮細胞穿透率明顯低于未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞（圖2B，P＜0.01）。肺癌腦轉移患者CIK細胞和經MIP-1α siRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞與HBMEC單層作用20 h，檢測跨內皮細胞電阻TEER值和Transwell下室HRP濃度發現，經MIP-1α siRNA干擾后的肺癌腦轉移患者CIK細胞的HBMEC跨內皮電阻TEER值顯著高于未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞（圖2C，P＜0.05），經MIP-1α siRNA干擾后的肺癌腦轉移患者CIK細胞HRP滲透力顯著低于未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞（圖2D，P＜0.05）。MIP-1α siRNA能阻斷肺癌腦轉移患者CIK細胞的跨內皮遷移，MIP-1α能誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞的跨內皮遷移。

圖2 肺癌腦轉移患者CIK細胞和MIP-1αsiRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞的滲透和遷移能力Fig.2 Penetration and transmigration ability of CIK cells from lung cancer patients with brain metastasis and MIP-1α siRNA-CIK cells

2.3 MIP-1α siRNA降低肺癌腦轉移患者CIK細胞對HCMEC的黏附性

細胞黏附試驗中發現，將MIP-1α siRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞與HBMEC相互作用1、2、3、4 h后，其細胞黏附力增加，并呈時間依賴性。但是與未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞對HBMEC粘附力相比，作用1 h時2組間無統計學差異，在相互作用2、3、4 h后，MIP-1αsiRNA干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞與HBMEC的黏附力顯著低于未被干擾的肺癌腦轉移患者CIK細胞（圖3，P＜0.05）。

圖3 MIP-1αsiRNA對肺癌腦轉移患者CIK細胞黏附HBMEC的影響Fig.3 Effect of MIP-1αsiRNA on adherence of CIK cells from lung cancer patients with brain metastasis to HBMEC

3 討論

肺癌腦轉移瘤在所有腦轉移瘤中占有很重要的比例［6］，其中小細胞肺癌較非小細胞肺癌更易發生腦轉移，肺腺癌腦轉移風險比鱗癌高［7］。患者的中位生存期僅3～12個月［8］。目前針對腦轉移瘤的治療主要以放療、手術治療、化療為主。目前這三種治療方法針對肺癌腦轉移瘤的治療的確有效，但是光靠這三種方法是遠遠不夠的，DC-CIK細胞免疫治療作為新一代腫瘤ACI方法，在提高患者免疫力、改善晚期癌癥患者生活質量、延長患者生存期等方面有著巨大的潛力。蔣琦等［9］報道了1例肺癌腦轉移患者，在放療、化療不耐受的情況下行DC-CIK治療，取得了生存期72個月、腦轉移后無疾病生存期23.5個月的良好療效。本研究表明，肺癌腦轉移患者的CIK細胞能高表達MIP-1α，MIP-1α能誘導肺癌腦轉移患者的CIK細胞在HBMEC構建的血腦屏障模型中跨內皮細胞遷移，為進一步研究CIK細胞進入血腦屏障抗顱內腫瘤提供理論依據。

趨化因子是一種低分子多肽，目前已發現達50余種，具體被分為CC、CXC、C及CX3C 4個家族［10］，MIP-1α是CC家族趨化因子的一種，它能趨化淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等各種白細胞向炎癥部位聚集，介導了免疫細胞對組織的浸潤、定位及活化［11］，MIP-1α通過CCR1和CCR5表達驅動DC前體細胞的動員，還可通過誘導MIP-3α，間接驅動CCR+DC前體招募［12，13］。MIP-1α主要由單核細胞、中性粒細胞、小膠質細胞和星形膠質細胞產生，有文獻［14，15］報道，阿爾茨海默癥患者激活的T細胞能高表達MIP-1α穿過血腦屏障，到達中樞神經系統參與免疫反應。而趨化因子家族的另一成員，人單核細胞趨化蛋白1（human monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）能與鼠腦微血管內皮細胞上表達的CCR2相互作用，增加腦微血管內皮細胞的通透性［4］，之前的研究［3］也表明，阿爾茨海默癥患者的外周T淋巴細胞中MIP-1α能過度表達，它能輔助T淋巴細胞遷移入腦。

本研究探討了肺癌腦轉移患者和健康人CIK細胞表達MIP-1α的能力，并對MIP-1α誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞在HBMEC模型中的透過率、遷移能力和細胞黏附力進行分析。發現肺癌腦轉移患者的CIK細胞表達MIP-1α的能力高于健康人CIK細胞。進一步用MIP-1α siRNA干擾肺癌腦轉移患者的CIK細胞，與未被干擾的肺癌腦轉移患者的CIK細胞比較，發現MIP-1α siRNA能阻斷肺癌腦轉移患者CIK細胞的跨內皮遷移，被MIP-1α siRNA干擾過的肺癌腦轉移患者CIK細胞對HCMEC的黏附性降低，說明MIP-1α能誘導肺癌腦轉移患者CIK細胞在HBMEC構建的體外血腦屏障模型中跨內皮遷移。本研究為CIK細胞透過血腦屏障機制的初步探索，從MIP-1α表達的角度分析了CIK細胞穿透血腦屏障的能力，為干預CIK細胞免疫治療肺癌腦轉移瘤提供了新的靶點。

［1］Ballen KK，Colvin G，Dey BR，et al.Cellular immune therapy for refractory cancers：novel therapeutic strategies［J］.Exp Hematol，2005，33（12）：1427-1435.

［2］Thorne SH，Negrin RS，Contag CH.Synergistic antitumor effects of immune cell-viral biotherapy［J］.Science，2006，311（5768）：1780-1784.

［3］Man SM，Ma YR，Shang DS，et al.Peripheral T cells overexpressMIP-1α to enhance its transendothelial migration in Alzheimer's disease［J］.Neurobiol Aging，2007，28（4）：485-496.

［4］Stamatovic SM，Keep RF，Kunkel SL，et al.Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction‘opening’：signaling via Rho and Rho kinase［J］.J Cell Sci，2003，116（Pt 22）：4615-4628.

［5］Hara T，Wakatsuki S，Ozaki S，et al.Primary adult T-cell leukemia/ lymphoma of bone［J］.Int J Hematol，2004，79（2）：157-160.

［6］Kawabe T，Phi JH，Yamamoto M，et al.Treatment of brain metastasis from lung cancer［J］.Prog Neurol Surg，2012，25：148-155.

［7］Lee DS，Kang JH，Lee CG，et al.Predicting survival in patients with advanced non-squamous non-small cell lung cancer：validating the extent of metastasis［J］.Cancer Res Treat，2013，45（2）：95-102.

［8］徐春華，于力克，張宇.肺癌腦轉移患者的臨床特征及預后分析［J］.腫瘤學雜志，2014，20（6）：468-470.

［9］蔣琦，錢其軍.DC-CIK細胞免疫治療肺癌腦轉移病例報告一例［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2015，22（2）：252-254.

［10］Kakinuma T，Hwang ST.Chemokines，chemokine receptors，and cancer metastasis［J］.J Leukoc Biol，2006，79（4）：639-651.

［11］任欣會，張會娟，高慧禎.趨化因子MIP-1α、MIP-1β、MCP-1在自身免疫性甲狀腺疾病中的表達及意義［J］.重慶醫科大學學報，2013，38（7）：776-779.

［12］吳雨崗，汪良，丘凌，等.趨化性細胞因子MIP-1α促小鼠外周血DC前體細胞動員的實驗研究［J］.現代免疫學，2005，25（3）：191-195.

［13］張春輝，金華，朱振亞，等.趨化因子MIP-1α和MIP-3α募集樹突狀細胞前體細胞的研究［J］.現代免疫學，2012，32（3）：210-215.

［14］曼淑梅，陳譽華.阿爾茨海默病患者外周血免疫細胞的亞型變化及其穿過血腦屏障的能力［J］.中國神經精神疾病雜志，2004，30（4）：266-269.

［15］Ransohoff RM，Kivis?kk P，Kidd G.Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system［J］.Nat Rev Immunol，2003，3（7）：569-581.

（編輯 于 溪）

MIP-1αEnhances Trans-endothelialMigration ofCIKCellsin Lung Cancer Patientswith Brain Metastasis

PIXin-miao1，3，LIZe-yu2，MAYi-ran2，LIDong-wen3
（1.Graduate SchoolofGrade 2013，Liaoning University ofTraditionalChinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.DepartmentofBlood Transfusion，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China；3.Cadre Ward，The 463rd HospitalofChinese People’s Liberation Army，Shenyang 110042，China）

Objective To evaluate the MIP-1α expression level of CIK cells in lung cancer patients with brain metastasis and healthy individuals，and explore the role of MIP-1 in trans-endothelial migration of CIK cells in lung cancer patients.Methods The CIK cells and human brain microvascular endothelial cell（HBMEC）were cultured，and MIP-1α siRNA was transfected into the CIK cells.The expression of MIP-1α was determined，and the ability of the MIP-1α transfected CIK cells on passing through the blood brain barrier was observed through trans-endothelial migration and celladhesion test.Results CIKcells ofpatients with brain metastasis from lung cancerexhibited over-expressed MIP-1α，and MIP-1αcan promote CIK cells to migrate through endothelial cells in the blood brain barrier model which constructed by HBMEC.Conclusion This study is a preliminary study of the mechanism of CIK cells penetrating the blood brain barrier，which provides a new target for the treatment of brain metastasis oflung cancer.

cytokine-induced killer cell；lung cancer；human brain micro-vascular endothelial cell

R733.7

A

0258-4646（2016）02-0141-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.010

遼寧省自然科學基金（2014020167）

皮新苗（1988-），男，碩士研究生.

李東文，E-mail：Ldw415985@sohu.com

2015-08-04

網絡出版時間：