重癥監護病房醫院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

陳　璐，李凌竹，冷應蓉，查筑紅，程永素，黃　冰，羅光英，王　敏，江銀輝（貴州醫科大學附屬醫院感染管理科，貴州貴陽 550004）

重癥監護病房醫院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究與分析

陳璐，李凌竹，冷應蓉，查筑紅，程永素，黃冰，羅光英，王敏，江銀輝（貴州醫科大學附屬醫院感染管理科，貴州貴陽 550004）

目的：通過分析菌株耐藥性和耐藥基因檢出情況，了解我院醫院感染耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的流行病學特點，并探討耐藥機制，為臨床合理選藥提供參考。方法：篩選重癥監護病房醫院感染患者送檢標本分離的CRAB，采用PCR擴增技術檢測菌株是否攜帶OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、armA、sul1和sul2基因。結果：53株醫院感染CRAB對復方新諾明、妥布霉素較敏感，對其余13種抗菌藥物耐藥率均達50%以上，基因檢出率依次為：TEM 100%，OXA-23 96.23%，armA 90.57%，aac(6')-Ib 22.64%，aac(3)-I 26.42%，aph(3')-I 73.58%，sul1 30.19%，sul2 56.60%，SHV 3.77%，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未檢出。共14組耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株。結論：我院醫院感染CRAB的患者仍可考慮選用復方新諾明和妥布霉素進行治療。我院定居并繁殖的CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關，攜帶OXA-23基因可能是耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素，檢出率低的耐藥基因可能在耐β-內酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。我院不僅存在科室內部的交叉感染，而且存在科室之間的交叉感染，應加大力度做好感染控制工作。

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌；耐藥；耐藥基因；醫院感染

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）已成為我國院內感染的主要致病菌之一，2014年中國CHINET細菌耐藥性監測網數據顯示，我國17所教學醫院鮑曼不動桿菌占臨床分離革蘭陰性菌的14.23%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。廣譜抗菌藥物的大量運用使鮑曼不動桿菌耐藥形勢嚴峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的比例逐年增高，細菌對碳青霉烯類耐藥即意味著對其他抗菌藥物基本耐藥[2]。重癥監護病房收治的患者免疫力低下、侵入性操作多，并長期使用各類廣譜抗菌藥物，感染CRAB的患者較多見。本研究重點考察重癥監護病房醫院感染患者所分離CRAB的耐藥性，初步了解我院醫院感染CRAB的流行病學特點，并探討耐藥性與耐藥基因的關聯性，以期為分子生物學研究及臨床合理用藥提供理論參考。

1　材料和方法

1.1菌株來源

53株CRAB分離源自2014年1月– 2015年5月貴州醫科大學附屬醫院重癥監護病房（ICU）醫院感染患者不同來源的標本（剔除同一患者同部位的重復標本）。醫院感染判斷標準遵循《醫院感染診斷標準》并結合臨床實際情況。

1.2細菌分離鑒定及藥敏試驗

采用美國德靈Microscan WalkAway 4.0系統對病原菌進行鑒定及藥敏試驗。質控菌株標準菌株PAE ATCC 27853購自貴州省臨床檢驗中心。藥敏紙片購自英國Oxoid公司。檢測菌株對阿米卡星、頭孢他啶、環丙沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、復方新諾明、替卡西林/克拉維酸、四環素、妥布霉素的敏感性。結果判定依據臨床實驗室標準化協會（CLSI）制定的標準。

1.3細菌處理

挑純培養菌，取1 mL細菌LB培養液于1.5 mL離心管內，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，用1 mL無菌蒸餾水重新懸浮細菌沉淀，離心（12 000 r·min-1）1 min去上清，加蛋白酶K（200 ng·mL-1）溶液500 μL，56 ℃水浴2 h，然后于沸水中水浴10 min，離心（12 000 r·min-1）1 min，取上清液即為基因檢測的模板液，于– 20 ℃冰箱保存備用。

1.4基因檢測

采用PCR法檢測15個耐藥基因，PCR儀為ABI2700型。引物序列根據數據庫NCBI（www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide）各基因序列完成設計，靶基因序列登錄號、引物序列及目的產物長度見表1。各反應體系為20 μL：上下游引物各l μL（10 μmol·L-1），dNTP 2 μL （2 mmol·L-1），10倍PCR緩沖液（含Mg2+）2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U（不計體積），超純水12 μL，模板液2 μL。PCR擴增熱循環參數為：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃ 30 s →55 ℃ ～ 62 ℃（根據引物的退火溫度）30 s → 72 ℃ 60 s，循環33個周期，最后72 ℃延長5 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統為英國Syngene公司的 G-BOX。

2　結果

2.1一般情況

53株CRAB中，急診ICU 11株，綜合ICU 26株，內科ICU 9株，神經ICU 6株，兒科ICU 1株；男性35株（66.04%），女性18株（33.96%）。詳見表2。

表1　耐藥基因PCR引物序列[3]Tab 1　PCR primer sequence of drug-resistant genes[3]

表2　CRAB的分類檢出情況Tab 2　The classification about the detection of CRAB

2.2耐藥情況分布

本研究檢測了53株醫院感染CRAB對15種抗菌藥物的耐藥情況，詳見表3。

表3　53株醫院感染CRAB的藥敏特點分布情況Tab 3　Distribution of the drug-sensitive characteristics of 53 strains of nosocomial acquired CRAB

2.3耐藥基因檢測情況分布

對妥布霉素敏感的16株CRAB，氨基糖苷類修飾酶基因檢出：armA（81.25%，13/16），aph(3')-I（75.00%，12/16），aac(3)-I（6.25%，1/16），aac(6')-Ib（0/16）。對復方新諾明敏感的33株CRAB，磺胺耐藥基因檢出：sul1（9.09%，3/33），sul2（48.48%，16/33）。詳見表4。

表4　53株醫院感染CRAB的耐藥基因檢測分布情況Tab 4　Distribution of the detection results of drug-resistant genes of 53 strains nosocomial acquired CRAB

2.4耐藥基因檢出與耐藥情況對比研究

共14組（每組2株細菌）耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株，其中綜合ICU 9組、神經ICU 2組、急診ICU 2組和內科ICU 1組。14組CRAB中，住院日期無交叉的有內科ICU組（16號2014-03-28入院，2014-05-14出院；37號2014-06-01入院，2014-07-07出院）；綜合ICU組（17號2014-04-23入院，2014-07-31出院；81號2015-01-02入院，2015-01-31出院；88號2015-01-16入院，2015-04-13出院；92號2014-10-22入院，2014-11-03出院）。不同ICU耐藥基因檢出與耐藥情況完全相同的菌株排列詳見表5。

3　討論

綜上，本研究結果提示，男性感染CRAB多于女性。鮑曼不動桿菌院內感染最常見的部位是肺部，是醫院獲得性肺炎尤其是呼吸機相關性肺炎重要的致病菌[4]，CRAB多分離自痰標本，考慮與重癥監護病房患者多使用呼吸機相關。60歲以上老年人送檢痰標本分離率最高，分析原因是由于老年患者呼吸器官退化，呼吸功能及咳嗽反射減弱，肺組織彈性減弱等導致排痰功能降低，更易在醫院內感染CRAB引起肺炎。

本研究結果表明，CRAB除對復方新諾明、妥布霉素較敏感外，對其余13種抗菌藥物耐藥率均達50%以上（見表3），耐藥形勢嚴峻。本院獲得的CRAB仍可考慮選用復方新諾明和妥布霉素進行治療,與湖北黃石、蘇州、廣東省中山市的報道結果并不一致[5-7]。產生抗菌藥物滅活酶是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制[2]，產酶與攜帶耐藥基因相關。53株CRAB對β-內酰胺類抗菌藥物均耐藥，同時所有菌株均攜帶TEM基因，故我院定居并繁殖的CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物的機制可能與TEM酶密切相關。有研究[8]曾證明OXA-23型碳青霉烯酶在鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥中起著重要作用。攜帶OXA-23基因可能是本院鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物的重要因素。SHV檢出低，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER均未檢出，檢出率低的耐藥基因可能在本院分離CRAB耐β-內酰胺類抗菌藥物機制中的作用不大。研究氨基糖苷類修飾酶基因和磺胺耐藥基因發現，對妥布霉素敏感的CRAB高檢出armA、aph(3')-I，低檢出aac(3)-I、aac(6')-Ib，對復方新諾明敏感的CRAB高檢出sul2，低檢出sul1，其關聯性有待進一步探討。

表5　各ICU耐藥基因和藥敏特點相同的菌株分布情況Tab 5　Distribution of the same drug resistance gene and drug sensitive characteristics of strains in each ICU department

考慮耐藥情況和耐藥基因檢出完全一致的菌株可能具有同源性，提示我院不僅存在科室內部的交叉感染，且存在科室間的交叉感染，尤其是內科ICU和綜合ICU存在長期定植菌，說明臨床的清潔消毒工作不徹底，科室之間傳播的流行病學特點值得深入研究。

[1] 胡付品，朱德妹，汪復，等.2014年CHINET中國細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2015，15（5）：401-410.

[2] Peleg AY,Seifert H,Paterson DL. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen[J]. Clin Microbiol Rev,2008,21(3): 538-582．

[3] Opazo A,Domínguez M,Bello H,et al. OXA-type carbapenemases in Acinetobacter baumannii in South America[J]. J Infect Dev Ctries,2012,6(4): 311-316.

[4] 陳佰義，何禮賢，胡必杰，等.中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識[J].中國醫學雜志，2012，92（2）：76-85.

[5] 鮑群麗，汪宏良，柯俊.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌臨床分布及耐藥譜動態觀察[J].中國感染控制雜志，2015，14（5）：311-313，316.

[6] 錢何布，浦秦華，倪曉艷，等.耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的耐藥性及其所致醫院獲得性肺炎的危險因素[J].中華臨床感染病雜志，2015，8（2）：113-117.

[7] 陸丹倩，顧向明，鄭煥東，等.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的分布及耐藥性分析[J].中國感染與化療雜志，2015，15（2）：175-177.

[8] Héritier C,Poirel L,Lambert T,et al. Contribution of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(8): 3198-3202.

The study and analysis of drug resistance genes of nosocomial infection CRAB in ICU

CHEN Lu,LI Ling-zhu,LENG Ying-rong,ZHA Zhu-hong,CHENG Yong-su,HUANG Bing,LUO Guang-ying,WANG Min,JIANG Yin-hui(The Infection Control Section of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective: To analyze the situation of antimicrobial resistance,related resistance genes and possible mechanism,and provide references for rational antimicrobial application and discover the epidemiological characteristics of CRAB in our hospital. Methods: PCR techniques were used to test OXA-23,TEM,SHV,VEB,CARB,DHA,VIM,IMP,PER,aac(3)-I,aac(6')-Ib,aph(3')-I,armA,sul1 and sul2 genes. Results: In addition to SMZ-TMP and tobramycin,resistant rate to 13 antibiotics were all over 50%. The detection rate of gene were TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60% and SHV 3.77%. VEB,CARB,DHA,IMP,VIM and PER were not detected. There were 14 bacterial groups which had the same drug resistance and drug resistance gene. Conclusion: SMZ-TMP and tobramycin can be used to cure the CRAB infected patients. The TEM gene may be closely related to β-lactams resistance. The OXA-23 may be a crucial factor for carbapenems resistance. Those genes with low detection rate may not play a big role in drug resistant mechanism. There are cross infection in the same department and among departments in our hospital,infection control should be strengthened.

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Drug resistance gene; Nosocomial infection

R978.1

A

1672 - 8157(2016)01 - 0052 - 04

貴州省科技計劃項目（黔科合SY字2013-3176號）

冷應蓉，女，主任技師，主要從事醫院感染管理。E-mail：49728467@qq.com

陳璐，女，主治醫師，主要從事病原菌耐藥機制研究。E-mail：49728467@qq.com

（2015-10-11

2015-12-16）