TGF-β1/Smad通路在血管緊張素Ⅱ下調縫隙連接蛋白43表達中的作用*

侯婧瑛， 周長青， 鄭韶欣， 郭天柱， 龍會寶， 伍權華， 鐘婷婷， 王 彤△

(中山大學孫逸仙紀念醫院 1急診科， 2心內科， 廣東 廣州 510120)

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TGF-β1/Smad通路在血管緊張素Ⅱ下調縫隙連接蛋白43表達中的作用*

侯婧瑛1， 周長青1， 鄭韶欣2， 郭天柱1， 龍會寶1， 伍權華1， 鐘婷婷1， 王 彤1△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1急診科，2心內科， 廣東 廣州 510120)

目的： 分析心肌梗死(MI)后心臟組織中血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、縫隙連接蛋白43(Cx43)和轉化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路相關因子的變化情況，以探討Ang Ⅱ 能否經由TGF-β1/Smad 調節Cx43的表達。方法: 采用左前降支冠狀動脈 (LAD) 結扎建立大鼠心肌梗死模型后，20只SD雄性大鼠隨機分為氯沙坦(20 mg·kg-1·d-1)治療組與MI組，分別于結扎后及治療2周后檢測心功能情況，并檢測治療2周后左室心肌組織不同區域Ang Ⅱ、Ang Ⅱ 1型受體 (AT1)、Cx43以及TGF-β1/Smad通路相關分子的變化情況。結果: 氯沙坦組左室舒張末期內徑(LVIDd)和左室收縮末期內徑(LVIDs)明顯縮小(P<0.01)，室間隔厚度(IVSd)及左室后壁厚度(LVPWd)明顯減小(P<0.05)，左室射血分數(LVEF)顯著增加(P<0.01)；梗死區和邊緣區的Ang Ⅱ水平明顯降低；梗死區AT1表達顯著降低；Cx43在心肌組織不同區域表達增高，TGF-β1、Smad 2、Smad 3在心肌組織不同區域表達均降低，而Smad 7表達增高。結論: 心肌梗死后Ang Ⅱ激活可能通過作用于TGF-β1/Smad通路導致Cx43表達下調。

血管緊張素Ⅱ； 縫隙連接蛋白43； 轉化生長因子-β1； Smad； 心肌梗死

急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)及伴隨而來的心力衰竭是嚴重威脅人類健康的心血管疾病之一[1]。現階段針對心肌梗死后心力衰竭的治療仍然是一個醫學難點。盡管采取了多種綜合防治措施，但心梗后心衰的病死率仍居高不下[2]，其根本原因在于相關發病機制尚未闡明。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統 (renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 的過度激活在心力衰竭的發病機制中占有重要地位, RAAS 的過度激活加重了心肌損傷和心室重構，并促進了心衰的進展，是影響預后和死亡的關鍵因素之一[3]。血管緊張素 Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 作為循環和局部RAAS的效應分子, 在心肌和血管組織的病理性重構過程中扮演重要角色。研究證實,阻斷 Ang Ⅱ介導的效應在心衰及心肌梗死后心功能不全的治療中有舉足輕重的作用，是改善心室重塑、心衰預后、降低死亡率的重要措施[4]。

惡性室性心律失常是急性心肌梗死和心力衰竭患者猝死的主要原因。心力衰竭時惡性室性心律失常的發生機制與心肌電重構密切相關。縫隙連接蛋白43 (connexin 43, Cx43) 是心臟組織縫隙連接蛋白中的一種，對心臟功能的維持起重要作用[5]。近年來，Cx43對心肌電生理重構的影響已經引起國內外研究者的廣泛重視[6-7]。目前有研究表明Ang Ⅱ與縫隙連接重構之間存在關聯性[8]，盡管如此，心肌梗死后心力衰竭狀態下Ang Ⅱ對Cx43 表達和分布的影響及具體調控機制卻鮮有研究報道。

轉化生長因子-β1(transforning growth factor-β1, TGF-β1)是一組調節細胞生長和分化的細胞因子，其不僅參與正常機體組織代謝和功能維持，在多種疾病病理生理過程中亦發揮重要作用[9]。既往研究表明心肌梗死后Ang Ⅱ激活引起的心肌纖維化與TGF-β1密切相關，可見TGF-β1是Ang Ⅱ的重要下游信號分子[10]。新近研究表明TGF-β1與Cx43的重構有關[11]。然而TGF-β1調節Cx43的具體通路仍未明確。在本研究中，我們通過分析心肌梗死后心臟組織中Ang Ⅱ、Cx43和TGF-β1/Smad通路相關因子的變化情況，以探討Ang Ⅱ能否經由TGF-β1/Smad信號通路調節Cx43的表達。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

6月齡清潔級健康雄性SD大鼠20只，體重(250±25) g，用于制備心肌梗死模型，上述動物均由中山大學動物實驗中心提供。模型制備成功后，隨機分為2組，氯沙坦組和MI組，每組10只大鼠，均全部存活。

2 主要試劑及設備

血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 1, AT1)鼠單克隆抗體、 Cx43兔多克隆抗體、Smad 2/3兔多克隆抗體和Smad 7兔單克隆抗體(Abcam)；TGF-β1兔多克隆抗體 (Santa Cruz)；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗 (Southern biotech)；Ang Ⅱ ELISA試劑盒(Ray Biotech)；Ⅱ抗及I抗稀釋液 (中杉金橋)；BCA法蛋白含量檢測試劑盒(Abcam)； PVDF膜和發光液 (Millipore)； TRIzol RNA 提取試劑盒(Santa Cruz)；HX-300S型呼吸機(泰盟科技有限公司)；超凈工作臺(Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；心臟超聲分析儀(Philips)；定量PCR用SYBR Green 試劑(Invitrogen)；定量PCR儀ABI PRISM?7500(Invitrogen)。

3 方法

3.1 大鼠心肌梗死模型的制備及治療分組 6 月齡Sprague-Dawley大鼠麻醉后，氣管插管并接呼吸機，從左側第4肋間打開胸腔，暴露心臟，用鑷子撕開心包膜，清楚暴露左前降支冠狀動脈，用帶5/0細尼龍絲線的小圓針縫扎左前降支冠狀動脈。關胸前放置細塑料軟管，便于關胸后引流及吸取氣體和滲出的血液。縫扎成功的標志是肢體心電圖ST 段明顯抬高，QRS 波寬大畸形，左室射血分數顯著降低，具體見課題組前期文獻[12-13]。20只大鼠隨機分為氯沙坦治療組和MI組。氯沙坦組于心肌梗死模型建立后第1天起灌胃法給予氯沙坦20 mg·kg-1·d-1，MI組予以喂水(等量)處理，2組均治療2周。

3.2 心臟超聲檢測 所有大鼠心肌梗死模型成功制備及治療2周后檢測心功能。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(0.04 g/kg)麻醉，仰臥位四肢固定于木板上，使木板向左傾斜30°。剃凈胸毛，連接Ⅱ導心電圖。多普勒檢測頻率為3～12 MHz。探頭置于胸骨左側，顯示胸骨左室長軸切面，探頭順時針旋轉90°顯示左室短軸切面。由二維圖像引導取M型曲線并進行測量。選擇清晰的圖像錄像待以后分析。檢測項目包括左室舒張末期內徑 (left ventricular internal dimension at diastole, LVIDd)、左室收縮末期內徑 (left ventricular internal dimension at systole, LVIDs)、左室后壁厚度 (left ventricular posterior wall depth, LVPWd)、室間隔厚度(interventricular septal thickness, IVSd)和左室射血分數 (left ventricular ejection fraction, LVEF)，超聲檢測完成后，再處死大鼠進一步做相關指標檢測。

3.3 ELISA法檢測 處死大鼠后將摘取整個心臟，仔細分離梗死區、梗死邊緣區、非梗死區的組織并迅速放置于-80 ℃的冰箱中保存。心肌 Ang Ⅱ濃度檢測采用ELISA 法，操作步驟按照說明書進行。

3.4 免疫熒光染色 心臟標本采用4%多聚甲醛固定24～36 h，常規脫水，石蠟包埋連續切片(切片厚度3～5 μm)并固定到載玻片上；常規脫蠟水化；抗原修復以充分暴露抗原，提高抗原的檢測率；滴加10%正常山羊血清室溫下封閉30 min，用于吸附組織中的非特異性位點，以免造成后續結果的假陽性。滴加I抗(1∶100)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加熒光標記Ⅱ抗(1∶200)室溫濕盒避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；加入DAPI于室溫下濕盒避光孵育5 min；PBS洗1次，5 min；滴加抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下觀察心肌梗死區、邊緣區、非梗死區Cx43的表達情況并拍照。

3.5 Western blot檢測 用500 μL RIPA裂解液(含PMSF和Cocktail)裂解100 mg心臟各區域組織30 min，4 ℃下14 000 r/min離心10 min，取上清組織中總蛋白,于-20 ℃或-80 ℃保存備用。采用BCA法測定各樣品蛋白濃度，常規SDS-PAGE及蛋白電轉，轉膜后的PVDF膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h或4 ℃過夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相應的I抗稀釋液4 ℃過夜或37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相應Ⅱ抗稀釋液37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5 min，3次；蒸餾水漂洗膜2 min, 3次；將總體積為0.125 mL/cm2膜面積的發光液均勻地加到膜的表面，室溫孵育5 min，小心吸去膜表面多余的發光液，放至暗盒后顯影。

3.6 Real-time PCR檢測 用液氮研磨組織至粉末，加入1 mL TRIzol溶液提取總 RNA。并使用核酸蛋白分析儀和1.6%瓊脂糖電泳對所提取的總RNA 進行分析。取總 RNA 液8 μL，70 ℃水浴5 min后加入逆轉錄反應液17 μL，42 ℃孵育60 min 后終止反應，留取產物待用。Real-time PCR 擴增參數：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s(40 個循環)；72 ℃ 10 min。反應結束后，由軟件自動計算出定量結果，具體引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物列表

4 統計學處理

所有數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件處理，兩獨立樣本的資料采用Student’s 雙尾t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 心功能檢測

大鼠心肌梗死模型建立后即刻進行基礎心功能檢測，2組相關參數包括LVIDd、LVIDs、LVPWd、IVSd、LVEF的比較沒有差異性, 見表2。 氯沙坦組與MI組接受相應治療2周后再次進行心功能檢測，氯沙坦組LVIDd和LVIDs明顯縮小(P<0.01)，IVSd及LVPWd明顯減少 (P<0.05)，LVEF則顯著增加 (P<0.01)，見表3。

2 心肌組織中Ang Ⅱ濃度的比較

ELISA法檢測左室心肌組織不同區域Ang Ⅱ濃度，結果顯示氯沙坦組Ang Ⅱ濃度在梗死區和邊緣區均低于MI組，差異有統計學意義 (P<0.05)，見圖1。

表2 2組大鼠基礎心功能情況的比較

表3 2組大鼠治療2周后心功能情況的比較

*P<0.05,**P<0.01vsMI.

Figure 1.Comparison of Ang Ⅱ level in the left ventricular (LV) cardiac tissue between two groups after treatment. IZ: infarct zone; BZ: border zone; NIZ: none infarct zone. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsMI.

圖1 2組大鼠左心室不同區域Ang Ⅱ濃度比較

3 心肌組織AT1的變化情況

采用免疫熒光，Western blot及real-time PCR對心肌組織不同區域AT1受體表達情況進行檢測，結果顯示氯沙坦組AT1在梗死區表達明顯下降(P<0.01)，見圖2。

4 心肌組織Cx43的變化情況

采用免疫熒光，Western blot及real-time PCR對心肌組織不同區域Cx43表達情況進行檢測，結果顯示與MI組相比，氯沙坦組Cx43左室心肌組織不同區域的表達均顯著增加(P<0.01)，見圖3。

5 心肌組織TGF-β1/Smad通路相關因子的變化情況

與MI組相比，氯沙坦組TGF-β1、 Smad 2和Smad 3蛋白水平在左室心肌組織梗死區和非梗死區表達均降低。Smad 7在不同區域表達均升高。Real-time PCR結果顯示：氯沙坦組TGF-β1、Smad 2和Smad 3 mRNA水平在左室心肌組織不同區域表達均降低(P<0.01)。Smad 7在不同區域表達均明顯升高(P<0.01)，見圖4。

Figure 2.Comparison of AT1 expression in different areas of left ventricular between two groups. A: immunofluorescence staining of AT1 (green fluorescence); B: Western blot analysis; C: real-time PCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsMI.

圖2 心肌組織不同區域AT1檢測結果

Figure 3.Comparison of Cx43 expression in different areas of left ventricular between two groups. A: immunofluorescence staining of Cx43 (green fluorescence); B: Western blot analysis; C: real-time PCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vsMI.

圖3 心肌組織不同區域Cx43檢測結果

討 論

心肌梗死后心室重構是心力衰竭發生發展的重要機制。RAAS的激活促進了心室重構及心功能惡化[3]。證據表明在心血管組織局部存在RAAS，并且組織局部RAAS增加與動脈硬化、心肌肥厚及充血性心力衰竭等密切相關[14]。循環及局部組織 RAAS 的激活導致Ang Ⅱ濃度升高，其通過與AT1相結合促進血管平滑肌收縮，抑制腎素分泌、增加血管加壓素釋放、刺激心肌肥大、促使心臟纖維化并誘發心律失常[3,15]。本研究采用左前冠狀動脈結扎制備大鼠心肌梗死模型，并對采用氯沙坦治療阻斷AT1以觀察抑制Ang Ⅱ的效應對心肌梗死后心功能的影響。結扎后的心功能檢測結果顯示2組心室內徑參數及左室射血分數均出現心肌梗死后的特征性變化，2組各個基礎心功能參數的比較無顯著差異性。與既往的基礎及臨床研究的結果相一致， 氯沙坦治療后，大鼠心功能明顯改善，表現為LVIDd、LVIDs、 IVSd及LVPWd明顯減低，LVEF顯著增高，可見采用血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker, ARB)在受體水平上對Ang Ⅱ進行阻斷有利于改善心肌梗死后心室重構及心功能[16]。在本研究中，對心肌組織Ang Ⅱ和AT1水平進行檢測發現，ARB治療后心肌組織梗死區，梗死邊緣區Ang Ⅱ水平明顯降低，AT1受體水平下調。Ang Ⅱ與心臟組織中的AT1和血管緊張素Ⅱ 2型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 2，AT2)均能夠進行結合。Ang Ⅱ的生物學效應主要通過AT1 介導，而Ang Ⅱ作用于AT2則能夠抑制組織重建并發揮心臟保護作用[3]。在本研究中，AT1受體阻斷后，梗死區域局部Ang Ⅱ的濃度出現降低，RAAS活性被抑制，我們考慮可能由于AT1被阻斷后，AT2的比例升高進而與Ang Ⅱ結合增加，由此引起了心臟組織局部中Ang Ⅱ濃度的下調，而這對于心室重構起到了一定的改善作用。

Figure 4.Expression of the molecules in TGF-β1/Smad signaling in different areas of left ventricular in the two groups. A: Western blot analysis; B: real-time PCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsMI.

圖4 2組心肌組織不同區域TGF-β1/Smad通路相關因子檢測結果

研究顯示Cx43參與心力衰竭的發生過程，在心力衰竭晚期，Cx43減少并伴有分布異常[17]。現發現血管緊張素對心肌細胞Cx43的表達有調控作用[7-8]。Ang Ⅱ和Cx43在心肌梗死后心室肥厚和心力衰竭以及心律失常的發生發展中均扮演關鍵角色。在RAAS激活的動物模型中，心律失常危險性同Cx43下降的水平并磷酸化狀態顯著相關，而RAAS抑制劑能夠提高Cx43總的水平和磷酸化水平，減少室速的發生率和改善存活率[7]。在心力衰竭、心肌梗死、心室肥厚等疾病狀態下均發現存在Cx43表達和分布的改變，而Ang Ⅱ受體拮抗劑能夠改善Cx43表達水平、分布和信號轉導，從而改善心室重構及減少心律失常的發生[18]。綜合以上可見Ang Ⅱ對Cx43的表達具有調控作用。在本研究中，我們檢測心肌梗死后氯沙坦2周治療組及MI組左心室心肌組織不同區域Cx43表達量的變化情況，發現氯沙坦治療組Cx43的表達在心肌組織不同區域較MI組明顯升高，并且梗死區及邊緣區Ang Ⅱ濃度明顯降低，表明心肌梗死后Ang Ⅱ的增高能夠下調Cx43表達。既往已有研究指出，表達人腎素和血管緊張素原基因的大鼠在Ang Ⅱ的誘導下出現致死性心律失常，同時伴有Cx43的顯著下降，而經氯沙坦治療能明顯改善這些大鼠的電重構和減少心律失常的發生[19]。本研究亦證實了心肌梗死后Ang Ⅱ的激活下調了Cx43的表達，氯沙坦治療能夠逆轉這種變化，并且在Cx43表達上調的情況下，大鼠心功能也出現了明顯改善。

TGF-β1是具有多種生物學功能的細胞因子。心肌梗死后心室重塑過程中TGF-β1表達增加，Smad被激活，由此促進了心肌間質纖維化，加重了心肌梗死后心室擴張，并最終引發心功能惡化[20]。研究證實Ang Ⅱ促進TGF-β1的表達[21]，應用ARB能減弱TGF-β1和Smad的活性，進而減輕再灌注心肌的纖維化病變，以達到對心肌梗死后心功能的保護作用[22]。在本研究中，心肌梗死后左心室不同區域均觀察到TGF-β1水平的增高，氯沙坦治療后其表達明顯下調，且TGF-β1的表達與梗死區和邊緣區Ang Ⅱ的濃度呈現一致性的變化，充分說明Ang Ⅱ激活導致TGF-β1表達上調，在受體水平阻斷Ang Ⅱ的效應后，TGF-β1顯著下降。對TGF-β1下游分子Smad 2、Smad 3及Smad 7進行檢測，結果發現Smad 2和Smad 3在梗死區、邊緣區及非梗死區均升高，氯沙坦治療2周后水平明顯降低。Smad 7是TGF-β1功能特有的內源性抑制因子[23]，正常心肌組織中有豐富的Smad 7表達，但MI并發纖維化后，Smad 7的表達降低，由此可導致TGF-β1信號的過度激活[24]。本研究發現心肌梗死后左心室不同區域Smad 7表達下降，并與TGF-β1、Smad 2、Smad 3呈現相反的變化，AT1拮抗劑治療后Smad 7表達顯著上調，提示心肌梗死后Ang Ⅱ激活了TGF-β1/Smads并導致Smad 7表達下降。

TGF-β1不僅作為Ang Ⅱ的下游因子，也調節縫隙連接介導的細胞信號傳遞并影響Cx43的表達[11]， TGF-β1的水平增高能夠抑制Cx43的表達，而抑制 TGF-β1可以阻止心臟組織Cx43的低表達[11, 25]。另有證據顯示Cx43能夠經由競爭性結合微管結構調節Smad 2和Smad 3 表達[26]。由此可見，TGF-β1對Cx43的表達具有負向調節作用。在本研究中，心肌梗死后左室心肌組織不同區域出現Cx43表達下降，而TGF-β1、Smad 2、Smad 3表達增高，Smad7表達降低；用AT1阻斷Ang Ⅱ的效應后左室心肌組織不同區域均出現Cx43表達上調，并且TGF-β1、Smad 2、Smad 3水平顯著下降，同時Smad 7表達明顯增高。據此，我們推測心肌梗死后Ang Ⅱ可能經由激活TGF-β1/Smad途徑引起Cx43的表達下調，而AT1阻滯劑能夠逆轉這種變化。

綜上所述，心肌梗死后Ang Ⅱ的激活引起心室重構及心功能惡化；Ang Ⅱ表達上調引發Cx43數量減少；Ang Ⅱ可能經由TGF-β1/Smad通路引起Cx43表達下降。以TGF-β1/Smad通路作為研究突破口, 將有助于從信號轉導和基因調控的水平改善心肌梗死后的心肌重構并延緩心功能惡化。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Role of TGF-β1/Smad signaling in angiotensin Ⅱ mediated down-regulation of connexin 43

HOU Jing-ying1, ZHOU Chang-qing1, ZHENG Shao-xin2, GUO Tian-zhu1, LONG Hui-bao1, WU Quan-hua1, ZHONG Ting-ting1, WANG Tong1

(1DepartmentofEmergency,2DepartmentofCardiology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:tongwang316@163.com)

AIM: To analyze the alterations of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ), connexin 43 (Cx43), angiotenisin Ⅱ receptor type 1 (AT1) and signaling molecules in the TGF-β1/Smad pathway in different regions of the left ventricular heart tissue for exploring whether Ang Ⅱ regulates Cx43 expression via the TGF-β1/Smad signaling pathway in myocardial infarction (MI) rats.METHODS: MI was induced in 20 male Sprague-Dawley rats by the left anterior descending coronary artery ligation. The rats were then randomized into 2 groups. In the losartan group, 20 mg·kg-1·d-1of losartan were administered for 2 weeks. Heart functions were assessed after surgery and 2 weeks later again following the above treatments. All the rats were sacrificed and relevant molecules, including Ang Ⅱ, AT1, and Cx43 were determined thereafter in diffe-rent areas of the left ventricle. TGF-β1 and its downstream signaling molecules, including Smad 2, Smad 3 and Smad 7, were also detected.RESULTS: In losartan group, both left ventricular internal dimension diastole (LVIDd) and left ventricular internal dimension systole (LVIDs) were smaller, with diminished interventricular septal thickness (IVSd) and left ventricular posterior wall depth (LVPWd) and distinct improvement of left ventricular ejection fraction (LVEF) (P<0.05). Losartan therapy exhibited a reduction of Ang Ⅱ in the infarct zone and the border zone in the cardiac tissues. AT1 was obviously attenuated in the infarct zone with an enhanced expression of Cx43, which was also elevated in the border zone and none infarct zone. TGF-β1, Smad 2 and Smad 3 were decreased in different zones of the left ventricle, while Smad 7, in contrary to the above factors, presented a converse alteration.CONCLUSION: The activation of Ang Ⅱ provokes downregulation of Cx43 through TGF-β1/Smad signaling pathway in MI rats.

Angiotensin Ⅱ; Connexin 43; Transforming growth factor-β1; Smad; Myocardial infarction

1000- 4718(2016)10- 1729- 08

2015- 12- 24

2016- 02- 24

國家自然科學基金資助項目(No.81270213； No.81070125)；廣東省科技計劃(No.2010B031600032； No.2014A020211002)；高校基本科研業務費中山大學青年教師重點培育項目(No.13ykzd16); 廣東省醫學科研基金(No.A2016264)

△通訊作者 Tel： 020-34071012； E-mail： tongwang316@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.001

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