上皮性卵巢癌中ALDH1和ABCG2的表達(dá)及其與微血管形成的關(guān)系*

俞 嵐， 宋文慶， 周 蕾， 武世伍， 王丹娜

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科, 蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室, 安徽省感染與免疫重點(diǎn)實驗室， 安徽 蚌埠 233000)

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上皮性卵巢癌中ALDH1和ABCG2的表達(dá)及其與微血管形成的關(guān)系*

俞 嵐△， 宋文慶， 周 蕾， 武世伍， 王丹娜

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科, 蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室, 安徽省感染與免疫重點(diǎn)實驗室， 安徽 蚌埠 233000)

目的： 本文旨在探討上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)中乙醛脫氫酶1(ALDH1)、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ABCG2)蛋白表達(dá)及微血管密度(microvessel density，MVD)之間的關(guān)系。方法：收集198例EOC術(shù)后標(biāo)本和60例卵巢良性上皮性腫瘤標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測EOC和卵巢良性上皮性腫瘤組織中ALDH1、ABCG2及CD105蛋白(微血管標(biāo)志物)的表達(dá)情況。結(jié)果：在EOC和卵巢良性上皮性腫瘤組織中，ALDH1和ABCG2的陽性表達(dá)率分別為64.1%、61.6%和8.3%、6.7%；MVD分別為22.6±9.7和5.03±3.35，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)； ALDH1和ABCG2的表達(dá)與EOC的組織學(xué)分化、FIGO分期、腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，MVD與EOC的組織學(xué)分化、FIGO分期、腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹水形成有關(guān)(P<0.05)；MVD分別與ALDH1和ABCG2的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，同時，ALDH1和ABCG2的表達(dá)亦呈正相關(guān)(P<0.01)。Kaplan-Meier生存分析表明，ALDH1和ABCG2的過表達(dá)以及MVD的增加均與患者的生存率有關(guān)，ALDH1和ABCG2表達(dá)陽性及MVD≥23的患者生存率明顯低于ALDH1和ABCG2表達(dá)陰性及MVD<23的患者(P<0.05)。多因素分析顯示FIGO分期、ALDH1表達(dá)、ABCG2表達(dá)和MVD是影響EOC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。結(jié)論：EOC組織中ALDH1和ABCG2過表達(dá)以及MVD與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等因素相關(guān)，這些指標(biāo)的聯(lián)合檢測可能作為對EOC的進(jìn)展及患者預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。

上皮性卵巢癌； 乙醛脫氫酶1； 腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2； 微血管密度； 預(yù)后

卵巢癌的發(fā)病雖然僅占女性惡性腫瘤病例的4%，但其死亡率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居于首位。其中，上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)占所有卵巢癌的90%[1]。惡性腫瘤發(fā)現(xiàn)越早，則預(yù)后越好，然而卵巢癌卻由于癥狀不明顯難以早期發(fā)現(xiàn)，被診斷時往往已經(jīng)到了疾病的晚期階段。盡管先進(jìn)的診斷技術(shù)和新穎的靶向藥物層出不窮，但仍有約70%的卵巢癌患者因化療耐藥在18 個月內(nèi)復(fù)發(fā)，患者5年生存率一直徘徊在30%左右[2]。此外，EOC易于侵襲和轉(zhuǎn)移的特性導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率較高。上述這些特征已成為對EOC患者早期診斷和有效治療的主要挑戰(zhàn)，尤其是靶向藥物及化療敏感性的提高對于降低卵巢癌死亡率至關(guān)重要。近來研究表明，目前惡性腫瘤患者的生存率低﹑手術(shù)及放化療治療后易于復(fù)發(fā)，最主要的原因是腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的存在。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是源于基因突變的多能干細(xì)胞，雖然這類細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中僅占很小一部分， 但該細(xì)胞亞群具有永久的自我更新和多向分化潛能， 可導(dǎo)致腫瘤的形成并且不斷生長[3]。乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是一種具有氧化、解毒功能的含鋅酶類，表達(dá)于正常及腫瘤組織中，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ALDH1 在多種惡性腫瘤的CSCs中呈高表達(dá)，可作為廣譜的CSCs標(biāo)志物之一[4-6]。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ATP-binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，通過結(jié)合和水解ATP將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，這一特性使ABCG2的功能與腫瘤細(xì)胞耐藥密不可分。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2 在干細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá)，隨著細(xì)胞的分化成熟其表達(dá)迅速下降，因此可將ABCG2 作為干細(xì)胞標(biāo)記之一[7]。CSCs長期生存和自我更新需要血管微環(huán)境的支持，微血管密度(microvessel density，MVD)則是反映微血管生成活性最常用的指標(biāo)[8]。進(jìn)行腫瘤抗血管治療能有效減少CSCs數(shù)量并有效限制腫瘤的生長[9]。因此，如能靶向惡性腫瘤的血管微環(huán)境則可能有效破壞CSCs，進(jìn)而達(dá)到更有效治療腫瘤的目的。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于ALDH1和ABCG2表達(dá)以及EOC微血管形成之間關(guān)系的相關(guān)報道。本研究主要通過免疫組化方法檢測198例EOC組織中ALDH1、ABCG2和CD105蛋白表達(dá)，分析ALDH1、ABCG2與MVD之間的相互關(guān)系，探討它們與EOC侵襲﹑轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 材料

收集安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2005年 1月～2011年12月存檔EOC石蠟包埋組織標(biāo)本198例 (患者術(shù)前未行放療、化療及其它抗腫瘤治療)和卵巢良性上皮性腫瘤組織標(biāo)本60例，所有病例均具備完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截止至2015年2月，隨訪時間為6～11月。患者年齡19～ 75歲，中位年齡51.7歲，≥52歲104例，<52歲94例。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟關(guān)于卵巢癌FIGO 2014手術(shù)-病理分期，早期(FIGOⅠ+Ⅱ期)卵巢癌99例，晚期(FIGO Ⅲ+Ⅳ期)卵巢癌99例；漿液性癌152例，黏液性癌28例，宮內(nèi)膜樣癌11例，透明細(xì)胞癌7例；高級別卵巢癌72例，低級別卵巢癌126例。腫瘤平均長徑(D)7.88 cm，D≥8.0 cm 78例，D<8.0 cm 120例。患者伴有腹腔臟器及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者74例，有腹水者81例。同時選擇60例良性上皮性卵巢腫瘤患者手術(shù)切除標(biāo)本作為良性對照組。本實驗經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行的。復(fù)閱上述患者的病理切片，選取存檔的患者手術(shù)標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片。

2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗體ALDH1和ABCG2均購自Abcam；鼠抗人單克隆抗CD105購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；EliVisionTMPlus試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)方法

所有EOC和對照組織標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，然后置于二甲苯溶液及濃度梯度的乙醇溶液脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)染色方法按照EliVisionTMPlus試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色后水洗，后經(jīng)蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、分化、返藍(lán)、脫水透明及樹膠封片。采用PBS液替代 I 抗作為陰性對照，陽性對照為已知ALDH1、ABCG2和CD105切片。

4 免疫組化結(jié)果判定

ALDH1和ABCG2主要是以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；CD105是以細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。ALDH1和ABCG2的免疫組織化學(xué)結(jié)果主要通過著色的強(qiáng)度和范圍綜合計分得出，即0分為不著色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；隨機(jī)選取10個高倍視野，計數(shù)陽性腫瘤細(xì)胞所占百分比，<10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩者相乘，得出積分結(jié)果，若積分<3分為陰性，若積分≥3分則為陽性。MVD計數(shù)主要通過CD105標(biāo)記陽性的小管狀結(jié)構(gòu)來計算，采用Weidner校正法[10]，于低倍鏡(×100)下選取4個視野，求其平均值進(jìn)行計數(shù)。所有免疫組化標(biāo)記結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師采用獨(dú)立雙盲法來判定。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。在EOC組中，ALDH1和ABCG2蛋白表達(dá)陽性組與陰性組以及MVD高低(MVD<23組與MVD≥23組)生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，上述指標(biāo)在EOC組織中表達(dá)與卵巢良性上皮性腫瘤組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用2檢驗、Spearman等級相關(guān)及t檢驗等，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ALDH1在EOC組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

ALDH1蛋白在EOC組織中的陽性表達(dá)率為64.1%(127/198)，在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為8.3%(5/60)，且良性組ALDH1蛋白表達(dá)強(qiáng)度較弱，兩組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EOC中，ALDH1蛋白的陽性表達(dá)率在高級別癌組要顯著高于低級別癌組(P<0.05)；臨床分期越晚，ALDH1蛋白的陽性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在伴有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其ALDH1 蛋白的陽性表達(dá)率要高于無轉(zhuǎn)移者，組間差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ALDH1 蛋白的陽性表達(dá)率與EOC患者的年齡、腫瘤大小﹑腫瘤組織學(xué)類型以及是否伴有腹水等因素之間差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖1、表1。

Figure 1.The expression of ALDH1 in EOC and ovarian benign epithelial tumor (EliVision,×400). A: EOC; B: ovarian benign epithelial tumor.

圖1 ALDH1在EOC及卵巢良性上皮性腫瘤組織的表達(dá)

2 ABCG2在EOC組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

ABCG2 蛋白在EOC組織中的陽性表達(dá)率為61.6%(122/198)，在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為6.7%(4/60)，且良性組ABCG2蛋白表達(dá)強(qiáng)度較弱，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。隨著EOC腫瘤組織學(xué)級別的增高，ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；同時，隨著EOC組織FIGO分期的增高，ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率也顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；伴有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率亦高于無轉(zhuǎn)移組，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。EOC組織中，ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率與患者年齡、腫瘤大小﹑組織學(xué)類型及有無腹水之間差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2、表1。

Figure 2.The expression of ABCG2 in EOC and ovarian benign epithelial tumor (EliVision,×400). A: EOC; B: ovarian benign epithelial tumor.

圖2 ABCG2在EOC及卵巢良性上皮性腫瘤組織的表達(dá)

3 EOC組織中MVD及其與臨床病理因素的關(guān)系

CD105蛋白表達(dá)于卵巢腫瘤的微血管，EOC組織微血管染色較強(qiáng)，而良性腫瘤組織染色較弱，大血管染色不明顯。微血管由棕黃色單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇構(gòu)成，管腔可有或無。凡血管腔直徑大于8個紅細(xì)胞或血管壁伴有明顯的肌層﹑纖維硬化﹑炎癥以及壞死的微血管均未計數(shù)。EOC組織中，MVD為22.6±9.7，顯著高于良性對照組(P<0.01)。MVD與患者年齡、腫瘤大小以及組織學(xué)類型之間差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性。隨著EOC的腫瘤組織學(xué)分化程度的降低、患者臨床分期期別的增加以及腹腔

器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹水的形成，腫瘤的MVD顯著升高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3、表1。

Figure 3.MVD in EOC and ovarian benign epithelial tumor (EliVision,×400). A: EOC; B: ovarian benign epithelial tumor.

圖3 EOC及卵巢良性上皮性腫瘤組織MVD

表1 198例EOC組織中ALDH1、ABCG2的表達(dá)及MVD與臨床病理因素的關(guān)系

4 EOC組織中ALDH1、ABCG2及MVD的相互關(guān)系

依據(jù)MVD中位值，將其分為MVD≥23組和MVD<23組。Spearman 相關(guān)分析顯示，ALDH1 蛋白的表達(dá)與MVD之間呈正相關(guān)關(guān)系P<0.01)；ABCG2蛋白的表達(dá)與MVD之間呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；ALDH1蛋白的表達(dá)與ABCG2蛋白的表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

5 Cox回歸分析

將EOC患者年齡(≥52歲組=1，<52歲組=0)、腫瘤直徑(≥8.0 cm組=1，<8.0 cm組=0)、腫瘤類型(漿液性癌組=0，黏液性癌組=1，宮內(nèi)膜樣癌組=2，透明細(xì)胞癌組=3)、腫瘤組織學(xué)分化(高級別癌組=1，低級別癌組=0)、FIGO分期(Ⅰ+Ⅱ期組=1，Ⅲ+Ⅳ期組=2)、腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移組=1，無轉(zhuǎn)移組=0)、腹水(腹水組=1，無腹水組=0)、ALDH1蛋白表達(dá)(陽性=1，陰性=0)、ABCG2蛋白表達(dá)(陽性=1，陰性=0)、MVD計數(shù)(MVD<23組=0，MVD≥23組=1)等因素引入Cox 模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ALDH1、ABCG2、MVD和FIGO分期是影響EOC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表2。

表2 EOC患者多因素生存分析

6 生存分析

本組病例總的5年生存率為38.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示，ALDH1蛋白表達(dá)陽性組與陰性組5年生存率分別為7.1%和81.7%，兩組生存曲線的差別有統(tǒng)計學(xué)顯著性，陽性組的生存率低于陰性組(P<0.01)；ABCG2蛋白表達(dá)陽性組與陰性組5年生存率分別為85.5%和8.2%，兩組之間生存曲線的差別有統(tǒng)計學(xué)顯著性，陽性組的生存率高于陰性組(P<0.01)；MVD≥23組與MVD<23組 5年生存率分別為10.5%和86.5%，組間生存曲線差別有統(tǒng)計學(xué)顯著性，MVD≥23組的生存率低于MVD<23組(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The survival curves of the EOC patients.

圖4 EOC患者生存曲線

討 論

CSCs是腫瘤組織中占極少比例的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，它與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等因素均密切相關(guān)[11]。根據(jù)CSCs假說，卵巢癌組織中具有無限增殖潛能的CSCs 是其發(fā)生、發(fā)展﹑復(fù)發(fā)及耐藥的根源，因此研究卵巢癌CSCs 的生物學(xué)特性、調(diào)控機(jī)制及靶向治療意義重大。ALDH1是ALDH 家族成員之一，人類ALDH1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其基因定位于9q21 染色體，是催化細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化為乙酸的細(xì)胞溶質(zhì)酶，并通過氧化視黃醇為視黃酸參與多種組織的分化和基因表達(dá)。ALDH1 首先在白血病干細(xì)胞被分離和鑒定，隨后發(fā)現(xiàn)其在多種CSCs中均有高表達(dá)。ALDH1在卵巢癌組織及細(xì)胞系中均有表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞系中分離出的ALDH1+細(xì)胞比陰性細(xì)胞更具化療抵抗性和致瘤性。ALDH1在紫杉醇和順鉑耐藥的細(xì)胞中高表達(dá)，在卵巢癌耐藥A2780 細(xì)胞株中分離出的ALDH1+細(xì)胞的致瘤能力是ALDH1-細(xì)胞的50倍，這些特性與CSCs的特性相一致[12]，這表明ALDH1可以作為卵巢癌干細(xì)胞的標(biāo)記。本實驗結(jié)果顯示，EOC中，ALDH1蛋白的表達(dá)要顯著高于良性對照組，并且其染色強(qiáng)度增加；在高級別癌組ALDH1蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于低級別癌組，且臨床分期越晚和伴有腹腔器官及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，ALDH1蛋白的陽性表達(dá)率越高，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。這些研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致，提示ALDH1高表達(dá)的卵巢癌患者其腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性，更易發(fā)生腫瘤耐藥，患者預(yù)后較差。

ABCG2是一種與多藥耐藥相關(guān)的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，又稱為多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。當(dāng)ATP與ABCG2的相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)合時，啟動ABCG2的轉(zhuǎn)運(yùn)泵功能，將細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥物泵出胞外從而使腫瘤細(xì)胞耐藥。因而ABCG2的表達(dá)情況與腫瘤患者的化療效果密切相關(guān)，高表達(dá)者療效不佳。有研究顯示，ABCG2蛋白的第482位氨基酸是不同耐藥表型的關(guān)鍵位置所在，殘基不同導(dǎo)致其對于不同底物的親和力不同。同時，化療藥物對ABCG2的表達(dá)亦有反作用，化療藥物可以使ABCG2基因啟動子去甲基化，引起ABCG2轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)， ABCG2表達(dá)上調(diào)，致使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥[13]。在許多實體性惡性腫瘤中，ABCG2+腫瘤細(xì)胞不僅耐受放化療，而且對于促進(jìn)干細(xì)胞增殖和干細(xì)胞表型的維持均具有重要作用，且其表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[14-15]，據(jù)此ABCG2可以作為腫瘤干細(xì)胞篩選的標(biāo)記物。孫大偉等[16]通過分選卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3中ABCG2+細(xì)胞，結(jié)果表明ABCG2+細(xì)胞所占比例較少，且較ABCG2-細(xì)胞具有更高的增殖能力、自我更新和分化潛能以及耐藥性，以及高表達(dá)干性基因這些基本特征，ABCG2+細(xì)胞可被視為卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，是研究卵巢癌干細(xì)胞較為理想的細(xì)胞模型。Hung等[17]認(rèn)為，ABCG2與惡性腫瘤的大小及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，其陽性表達(dá)提示腫瘤預(yù)后差，可以作為評估患者預(yù)后獨(dú)立指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示，EOC組ABCG2蛋白的表達(dá)要顯著高于良性對照組，隨著EOC組織分化程度的降低及臨床期別的增高，ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率顯著增加，并且伴有轉(zhuǎn)移組中ABCG2蛋白的陽性表達(dá)率亦高于無轉(zhuǎn)移組，組間差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

新生血管的啟動是惡性腫瘤演進(jìn)過程中的早期事件，這些血管在為腫瘤組織提供營養(yǎng)支持的同時，也為腫瘤細(xì)胞得以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)提供了重要途徑，而且腫瘤細(xì)胞也更易于進(jìn)入這些基底膜發(fā)育不健全的新生血管。CD105是血管內(nèi)皮標(biāo)記物的新成員，是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β(transform growth factor-β, TGF-β)受體復(fù)合物的成分之一。與傳統(tǒng)的泛血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34、CD31相比，CD105僅選擇性地表達(dá)于高增殖性的內(nèi)皮細(xì)胞，因此目前被認(rèn)為是一種最好的新生血管標(biāo)志，它能夠更精確地衡量腫瘤血管的生成活性[18]。MVD-CD105不僅可以定量反映腫瘤血管的生長情況，還能提示腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的趨勢，與腫瘤患者自身的危險度、預(yù)后之間的關(guān)系更為密切，因此這一指標(biāo)被認(rèn)為是評價腫瘤新生血管的金標(biāo)準(zhǔn)。已有報道顯示，MVD-CD105 在卵巢癌組織呈現(xiàn)高表達(dá)，在良性卵巢腫瘤中低表達(dá)，提示CD105可能在卵巢癌血管形成中起重要作用，可以作為檢測卵巢癌新生血管生成的理想標(biāo)志物。本實驗發(fā)現(xiàn)，EOC組織中的MVD-CD105計數(shù)要顯著高于對照的良性腫瘤組，并且EOC組微血管陽性染色增強(qiáng)，進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，隨著EOC組織學(xué)分化程度的降低、FIGO分期期別的增加以及轉(zhuǎn)移和腹水的形成，腫瘤的MVD計數(shù)顯著升高，提示內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性增高，促進(jìn)EOC侵襲及復(fù)發(fā)的能力增強(qiáng)。EOC組織大量微血管的增生，更容易造成癌細(xì)胞進(jìn)入微血管，進(jìn)而通過血道轉(zhuǎn)移的機(jī)會大大增加，由此形成的癌栓則有可能堵塞或破壞腹膜的微血管，導(dǎo)致患者伴發(fā)腹水的產(chǎn)生。

多因素分析顯示，ALDH1、ABCG2的表達(dá)、MVD計數(shù)以及FIGO分期是影響EOC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因素。這一結(jié)果可能為臨床提供了新的EOC生物學(xué)行為相關(guān)的分子標(biāo)志物。進(jìn)一步的生存分析表明，ALDH1、ABCG2表達(dá)陽性組及MVD≥23組，患者的5年生存率顯著低于表達(dá)陰性組及MVD<23組，提示ALDH1和ABCG2蛋白表達(dá)陽性率高以及MVD計數(shù)高的EOC患者，其生存時間短、預(yù)后差。

EOC組織中，關(guān)于ALDH1與ABCG2的表達(dá)與微血管形成之間相關(guān)性的研究，國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報道。本實驗Spearman 相關(guān)分析顯示，隨著ALDH1和 ABCG2的表達(dá)增強(qiáng)，EOC組織MVD計數(shù)顯著增加，分別呈正相關(guān)關(guān)系，同時，ALDH1與ABCG2表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果提示，EOC中ALDH1與ABCG2的表達(dá)與微血管形成之間可能存在某種聯(lián)系。關(guān)于腫瘤的微血管形成，在腫瘤干細(xì)胞學(xué)說問世前，學(xué)者們都認(rèn)為腫瘤的微血管來源于宿主，然而隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出，以及隨后的由腫瘤細(xì)胞直接構(gòu)成的“血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)”和由血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共同參與組成的“馬賽克(mosaic)血管”的相繼出現(xiàn)，才有學(xué)者提出，腫瘤中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞一樣，也是分化不成熟的細(xì)胞，同樣也具有侵襲性[19]。關(guān)于各種血管生成方式與EOC患者生存預(yù)后的相關(guān)性一直是本課題組研究的重點(diǎn)。我們在前期實驗中，曾經(jīng)證實了EOC中存在VM的血供形式，并且伴有VM的EOC患者生存率更低、預(yù)后更差[20]。那么CSCs在惡性腫瘤血管形成中充當(dāng)何種角色、發(fā)揮怎樣的作用呢？在膠質(zhì)瘤病灶中，ABCG2表達(dá)水平明顯升高，且其表達(dá)主要集中于新生血管管腔表面，研究者推測ABCG2 陽性的干細(xì)胞具有向腫瘤血管細(xì)胞分化的潛能，可能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，或直接參與腫瘤組織血管壁的組成[21-22]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ALDH1+干細(xì)胞樣細(xì)胞可能通過提高VEGF表達(dá)的方式促進(jìn)新血管的生成，增加微血管密度，為腫瘤提供了豐富的營養(yǎng)及氧供，促進(jìn)了腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[23-24]。當(dāng)惡性腫瘤快速生長的時候，腫瘤組織缺氧成為普遍存在的問題，這就導(dǎo)致CSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間建立起一定的內(nèi)在聯(lián)系。一方面，CSCs線粒體代謝產(chǎn)物能夠抑制脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain enzyme，PHD)活性，提高HIF-1穩(wěn)定性，促進(jìn)VEGF和促紅細(xì)胞生成素的生成，提高腫瘤血管化，增加腫瘤細(xì)胞血供，形成一個更適合腫瘤干細(xì)胞生存的微環(huán)境，以滿足其快速生長的需要，并使得細(xì)胞遷移和侵襲能力得到增強(qiáng)[25]；而另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過直接作用于腫瘤細(xì)胞或者產(chǎn)生細(xì)胞因子等途徑來影響CSCs的生物學(xué)行為[26]，例如，內(nèi)皮細(xì)胞分泌因子能夠通過上調(diào)Bmi-1 的表達(dá)促進(jìn)CSCs的自我更新過程[27]；內(nèi)皮細(xì)胞也能通過分泌IL-8使CSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[28]。上述機(jī)制都有力證明了惡性腫瘤中CSCs與其微血管形成之間確實存在密切聯(lián)系，而作為卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記的ALDH1和ABCG2，其表達(dá)水平的變化與微血管形成在EOC惡性進(jìn)展中的也同樣存在相關(guān)關(guān)系，但其具體分子發(fā)生是否遵循上述機(jī)制，或是還有其它可能的途徑，還有待我們進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)與證實。

綜上所述，EOC組織中，ALDH1和ABCG2蛋白表達(dá)的增高可能促進(jìn)了癌組織的侵襲演進(jìn)，同時也可能通過促進(jìn)腫瘤大量微血管的新生，導(dǎo)致癌組織進(jìn)一步侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，ALDH1、ABCG2和MVD可能作為評估EOC患者轉(zhuǎn)移和生存預(yù)后的重要指標(biāo)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Correlation between expression of ALDH1/ABCG2 and microvessel formation in epithelial ovarian cancer

YU Lan, SONG Wen-qing, ZHOU Lei, WU Shi-wu, WANG Dan-na

(PathologicalDepartmentofFirstAffiliatedHospital,DepartmentofPathology,BengbuMedicalCollege,AnhuiKeyLaboratoryofInfectionandImmunology,Bengbu233000,China.E-mail:yulan790210@163.com)

AIM: To elucidate the correlation between the expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1)/ATP-binding cassette subfaminly G member 2 (ABCG2) and microvessel density (MVD) in epithelial ovarian cancer (EOC). METHODS: In 198 specimens of EOC and 60 specimens of ovarian benign epithelial tumor tissues, the protein expression of ALDH1/ABCG2 and CD105 (microvessel marker) was detected by immunohistochemical staining. RESULTS: The positive rates of ALDH1 and ABCG2 in the EOC were 64.1% and 61.6%, respectively, while the positive rates in benign epithelial tumor tissues were 8.3% and 6.7%, respectively, and there were significant differences between them (P<0.05). In EOC and benign epithelial tumor tissues, the MVD were 22.6±9.7 and 5.03±3.35， respectively, and the difference was also significant (P<0.05). The expression of ALDH1 and ABCG2 in EOC was significantly related to differentiation, FIGO stage,and abdominal organ and lymph node metastasis (P<0.05). MVD had correlation with differentiation, FIGO stage, ascite, and abdominal organ and lymph node metastasis (P<0.05). MVD had positive correlation with the expression of ALDH1 and ABCG2 (P<0.01). There was also a positive correlation between the expression of ALDH1 and ABCG2 (P<0.01). Over-expression of ALDH1/ABCG2 and MVD≥23 were related to the poor prognosis. The survival rates in ALDH1/ABCG2 positive and MVD≥23 groups were significantly lower than those in ALDH1/ABCG2 negative and MVD<23 groups (P<0.05). The FIGO stage, the expression of ALDH1/ABCG2 and MVD were indepen-dent prognosis factors of EOC (P<0.05). CONCLUSION: The results suggest that the expression of ALDH1/ABCG2 and MVD in EOC are related to differentiation, lymph node metastasis, clinical stage and prognosis. Combined detection of these indexes may play an important role in predicting the progression and prognosis of EOC.

Epithelial ovarian cancer; Aldehyde dehydrogenase 1; ATP-binding cassette subfamily G member 2; Microvessel density; Prognosis

1000- 4718(2016)10- 1807- 08

2016- 03- 18

2016- 06- 20

高校省級優(yōu)秀青年人才基金資助項目 (No.2012SQRL094)；蚌埠醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)類重點(diǎn)項目(No.BYKY1416ZD)

△通訊作者 Tel: 0552-3070209; E-mail: yulan790210@163.com

R737.31; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.012

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