HOXB7基因沉默對人胃癌細胞活力、遷移和侵襲的影響

張偉麗， 陳 超

(信陽職業技術學院醫學院， 河南 信陽 464000)

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HOXB7基因沉默對人胃癌細胞活力、遷移和侵襲的影響

張偉麗△， 陳 超

(信陽職業技術學院醫學院， 河南 信陽 464000)

目的： 探討靶向沉默HOXB7基因對人胃癌SGC-7901細胞活力、遷移和侵襲作用的影響及潛在機制。方法: 設計靶向HOXB7的siRNA，然后瞬時轉染胃癌SGC-7901細胞，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測siRNA靶向沉默的效果。MTT法檢測細胞的活力，Western blot法檢測細胞周期相關蛋白CDK4和cyclin D1蛋白的表達水平，Transwell小室侵襲實驗檢測SGC-7901細胞的侵襲能力，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測胃癌SGC-7901細胞PTEN和VEGF的表達水平以及p-AKT的蛋白水平。結果: 胃癌組織中HOXB7基因在mRNA和蛋白水平的表達均顯著高于對照組織。siRNA可有效靶向沉默SGC-7901細胞中HOXB7的表達，且沉默HOXB7表達后SGC-7901細胞活力明顯下降，同時細胞周期相關蛋白CDK4和cyclin D1的表達亦下調。靶向沉默HOXB7可明顯抑制SGC-7901細胞中AKT的磷酸化水平，抑制胃癌細胞的侵襲轉移，同時下調VEGF的表達水平，抑制胃癌組織中的腫瘤血管生成。結論:HOXB7作為一個癌基因，可上調細胞周期相關蛋白CDK4、cyclin D1和侵襲相關分子VEGF的表達，上調AKT的磷酸化水平，進而抑制PTEN的功能，促進胃癌細胞SGC-7901的生長、遷移和侵襲能力。

HOXB7基因； 胃癌； 細胞活力； 細胞侵襲； 細胞遷移

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，流行病學調查顯示在我國胃癌仍舊是第4位的惡性腫瘤，在癌癥死亡譜中胃癌居于第3位，僅次于肺癌和肝癌，嚴重危害人民的生命健康[1]。胃癌周圍的淋巴組織較為豐富，極易發生局部的浸潤和轉移[2-3]，因此盡管藥物治療在不斷改進，胃癌的5年生存率顯著低于30%[4]，因此研究胃癌增殖、侵襲和轉移的機制對于胃癌的治療具有重要意義。

HOX為一類編碼轉錄因子參與調控組織器官分化發育的基因家族[5]，HOX基因通常分為I類和II類，其中I類HOX基因即為我們通常所說的HOX基因，其又分為幾個亞系包括HOXA、HOXB、HOXC和HOXD。HOX基因直接編碼轉錄調控因子或通過調控轉錄因子的表達間接調控許多基因的表達[6]。HOX的表達具有器官特異性，在食管癌中HOXA9基因啟動子區域甲基化程度升高而表達下調[7]，然而在急性淋巴細胞性白血病中HOXA9基因的表達上調[8]。HOXB13基因在前列腺中表達下調而在侵襲性乳腺導管癌中的表達顯著升高[9]，因此HOX基因在癌癥中的具體作用要視器官特異性而定。HOXB7作為HOX家族的一員，不僅參與調節正常組織器官的生長發育[10]，而且在腫瘤細胞中高表達介導腫瘤細胞的侵襲和轉移[5]。在胃癌組織的一項基因芯片分析結果顯示HOXB7基因在胃癌組織中表達較癌旁組織中明顯升高[11]，表明HOXB7基因表達水平可能和癌癥的侵襲以及不良預后有關[12-13]。HOXB7對胃癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，目前尚不可知。因此，本研究通過構建HOXB7 siRNA瞬時轉染胃癌SGC-7901細胞，觀察SGC-7901細胞的活力、侵襲以及遷移能力，探究HOXB7調控胃癌腫瘤細胞生長、侵襲和轉移的潛在機制，尋找胃癌治療的潛在靶位點，為胃癌的防治提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 細胞和試劑

人胃癌組織取自我科2015年3月～2015年12月間的行胃大部切除術的胃癌患者癌癥組織，共48例。所有樣本都經通過組織病理學診斷判斷癌癥分級，選擇胃癌分級在ⅠB期的隆起型癌癥組織作為實驗組研究對象，將癌旁3 cm的正常組織作為對照組研究對象。在術前告知患者取胃癌標本的目的，并簽署知情同意書，且該研究方案已經通過醫院倫理委員會審批。

人胃癌SGC-7901細胞購于ATCC。胎牛血清(Gibco)；DMEM培養基(Thermo)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma。抗HOXB7、CDK4和cyclin D1多克隆抗體,抗tubulin、AKT、p-AKT、PTEN和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；HOXB7、VEGF、cyclin D1、CDK4和PTEN引物用Premier primer 5.0設計，由上海杰李生物技術有限公司合成；HOXB7 siRNA(上海吉凱基因有限公司)；增強化學發光試劑盒(Pierce)；PVDF 膜、Transwell小室(Milliproe)；轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)；熒光染料Prime Script?反轉錄試劑盒和SYBR Green(TaKaRa)。

2 方法

2.1 檢測胃癌組織中HOXB7基因的表達水平 首先運用real-time PCR法在mRNA水平檢測胃癌組織以及癌旁組織中HOXB7的表達，同時在蛋白水平運用Western blot法檢測胃癌組織以及癌旁組織中HOXB7的蛋白表達(具體方法見2.5和2.6)。

2.2 細胞培養和siRNA轉染 SGC-7901細胞用含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，待細胞生長密度約為80%后，將細胞均勻地鋪板于12孔細胞培養板中，待細胞貼壁密度達70%時，按Lipofectamine2000的說明書進行轉染。細胞實驗分為未轉染對照組、轉染siRNA control的陰性對照組及轉染HOXB7 siRNA的基因沉默組。

2.3 MTT法檢測細胞活力 將對數生長期的SGC-7901細胞均勻接種于 96 孔板，每孔200 μL，每組設4個復孔。轉染6 h后換含10%胎牛血清的DMEM培養液，于培養24 h、48 h和72 h后棄培養基，在避光條件下每孔加入100 μL MTT溶液(1 g/L)繼續培養4 h，然后避光條件下每孔加入DMSO 200 μL，室溫下放置30 min，振蕩 5 min后于酶標儀上以空白孔調零，測定570 nm波長處各孔的吸光度(A)值。以時間為橫坐標，各孔的A值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

2.4 Transwell小室侵襲試驗檢測癌細胞的侵襲能力 在Transwell上層小室中加入DMEM培養基和Matrigel 1∶1混合的稀釋膠100 μL，37 ℃孵育6 h。收集轉染后的各組細胞消化制作成6×104/L的單細胞懸液，每孔500 μL接種于Transwell上層小室。將含有10%胎牛血清的DMEM培養基加入Transwell下層小室，在 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養 24 h。輕輕地擦去小室上層貼壁生長但未能穿過膜的細胞，在95%乙醇中固定15 min后吸掉乙醇，加1 g/L的結晶紫染色40 min后洗去多余染料，晾干加蓋玻片明膠封片，200倍放大鏡下觀察透膜細胞數。

2.5 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達水平 接種SGC-7901細胞于10 cm細胞培養皿中，轉染siRNA后繼續培養48 h后收集細胞，按照TRIzol試劑盒的指示步驟提取SGC-7901細胞中的RNA，依照Invitrogen的M-MLV逆轉錄系統進行反轉錄得到cDNA，參照SYBR Green PCR系統進行實時熒光定量PCR檢測相關基因的表達，相關引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

2.6 Western blot法檢測蛋白的表達水平 為了檢測胃癌中HOXB7的表達及其在胃癌增殖、侵襲中的作用，我們利用Western blot法檢測了HOXB7以及VEGF-AKT信號通路相關分子的變化。首先利用組織裂解液RIPA提取胃癌組織或者siRNA轉染后的SGC-7901細胞總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。取等量蛋白樣品于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，電泳結束后將其轉至硝酸纖維素膜上，分別用相應的抗體孵育，顯影，用CCD成像系統收集條帶信號。使用 ImageJ軟件進行條帶灰度分析, 以目的蛋白條帶灰度與內參照蛋白條帶灰度的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

3 統計學處理

使用SPSS 16.0 軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多因素的組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間的兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 胃癌組織中HOXB7 mRNA和蛋白的表達水平

根據實時熒光定量PCR的檢測結果，HOXB7 mRNA在胃癌組織中的表達量較癌旁組織明顯升高，將對照組(癌旁組織)歸一化處理后，癌組織中HOXB7的表達水平較對照組升高約5倍(P<0.01)。Western blot實驗結果同樣顯示HOXB7的蛋白水平在胃癌組織中的表達較癌旁組織顯著升高，見圖1。

Figure 1. The mRNA (A) and protein (B) expression levels of HOXB7 in the gastric carcinoma tissue. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 人胃癌腫瘤組織中HOXB7基因的表達水平

2 siRNA靶向沉默HOXB7基因表達的效果

用實時熒光定量PCR檢測HOXB7 mRNA的相對表達量，可見轉染siRNA的基因沉默組與各對照組(未轉染的空白對照組和轉染siRNA control的陰性對照組)相比明顯降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)，而未轉染的空白對照組和轉染siRNA control的陰性對照組之間差異無統計學顯著性；Western blot實驗結果同樣顯示siRNA干擾后HOXB7蛋白的表達量明顯降低，這表明HOXB7 siRNA的沉默效果有效，沉默效率約為75%，見圖2。

Figure 2.Silencing effect of siRNA onHOXB7 expression at mRNA (A) and protein (B) levels in the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssh-HOXB7 group.

圖2 siRNA轉染SGC-7901細胞的沉默效果

3HOXB7基因靶向沉默對SGC-7901細胞活力的影響

如圖3所示，HOXB7基因沉默組24 h、48 h和72 h后細胞活力明顯低于未轉染的空白對照組和轉染siRNA control的陰性對照組，說明HOXB7基因靶向沉默可以抑制SGC-7901細胞的存活率。

4HOXB7基因靶向沉默對SGC-7901細胞中周期相關蛋白 CDK4和cyclin D1表達的影響

圖4所示,HOXB7基因沉默組CDK4和cyclin D1的mRNA水平均明顯低于空白對照組和siRNA control陰性對照組。同時HOXB7基因沉默組CDK4和cyclin D1的蛋白表達強度均較其他2組明顯降低，灰度計算結果差異有統計學顯著性(P<0.05)，表明HOXB7基因靶向沉默后SGC-7901細胞活力的下降可能與周期相關蛋白CDK4和cyclin D1表達下調有關，見圖4。

Figure 3. The effect of HOXB7 on the viability of the SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssh-HOXB7 group.

圖3 SGC-7901細胞中的HOXB7對細胞存活率的影響

Figure 4.The effect of HOXB7 on the expression of cell cycle-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssh-HOXB7 group.

圖4 SGC-7901細胞中HOXB7對細胞周期相關蛋白的影響

5HOXB7基因靶向沉默對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

通過Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力，與未轉染空白對照組和轉染siRNA control的陰性對照組比較，轉染HOXB7 siRNA的基因沉默組中染色陽性的細胞數量即穿膜細胞數量減少，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The effect of HOXB7 on cell invasion ability (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssh-HOXB7 group.

圖5 SGC-7901細胞中HOXB7對細胞侵襲能力的影響

6HOXB7基因靶向沉默對SGC-7901細胞中侵襲相關分子表達的影響

如圖6所示，HOXB7基因沉默組VEGF的mRNA表達水平明顯低于空白對照組和siRNA control陰性對照組，而PTEN的mRNA表達水平則升高。同時HOXB7基因沉默組VEGF蛋白的表達水平和AKT的磷酸化水平均較其它2個對照組降低，同時HOXB7基因沉默后PTEN的表達水平升高，差異有統計學顯著性(P<0.05)。

Figure 6.The effect of HOXB7 on the expression of the cell invasion-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssh-HOXB7 group.

圖6 SGC-7901細胞中的HOXB7對細胞中細胞侵襲相關蛋白的影響

討 論

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一[14]，通常在胃癌出現明顯癥狀時多已經發生轉移[15]，而且胃癌術后病人多發生轉移通常導致胃癌病人的術后五年生存率很低[16]。目前對于HOXB7在胃癌中的作用目前尚不明確，基因芯片檢測結果顯示HOXB7基因在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織[17]，同樣，我們搜集我科術后胃癌患者手術標本，發現在胃癌組織中HOXB7的水平，無論是mRNA還是蛋白水平均顯著高于癌旁組織(相對正常)，因此我們猜測HOXB7可能在胃癌的增殖、轉移和侵襲中具有一定的作用。

為了研究HOXB7對胃癌增殖、轉移和侵襲的影響，本研究利用siRNA干擾HOXB7后，SGC-7901細胞的活力、轉移和侵襲能力均明顯下調，提示HOXB7基因可能與胃癌的轉移和侵襲有關。同時我們進一步探討其中的機制，發現HOXB7基因沉默后的SGC-7901細胞CDK4和cyclin D1水平下調，細胞的活力下降。腫瘤的侵襲及轉移是一個復雜的過程，首要的條件就是細胞間基質和基底膜的破壞，突破局部組織的組織學屏障[18]。其次是在遠處轉移組織形成新生血管，供應高耗能腫瘤組織的能量供應。HOXB7干擾后的SGC-7901細胞中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)下游分子VEGF表達下調[19-20]，表明HOXB7基因在胃癌中可能作為一個癌基因的角色，促進細胞外基質降解和腫瘤血管的生成，共同促進腫瘤細胞的轉移和侵襲能力。PI3K/AKT信號通路參與調控胃癌細胞的侵襲力，有研究表明胃癌組織中的AKT磷酸化水平較周圍癌旁組織明顯升高，PI3K/AKT信號通路下調腫瘤抑制因子PTEN的表達導致PTEN功能喪失，PTEN功能下調可以顯著促進胃癌上皮細胞間質化，促進細胞癌變和轉移。因此我們進一步設計實驗探索AKT磷酸化水平和PTEN的表達水平與HOXB7、胃癌組織侵襲轉移之間的機制關聯。我們發現在沉默HOXB7基因的SGC-7901細胞中，AKT磷酸化水平下降的同時PTEN的表達水平上升，這表明HOXB7可能通過上調AKT的磷酸化，抑制PTEN的表達，促進胃癌細胞的癌變、侵襲和轉移。

有研究表明HOXB7與上皮細胞間質轉化有關，HOXB7蛋白參與破壞細胞連接蛋白和細胞骨架重調，改變細胞形態。因此我們下一步將研究HOXB7基因和胃癌細胞骨架蛋白重調的關系和相關的分子機制。

綜上說述，我們發現HOXB7可能參與胃癌的生長、侵襲和轉移，其機制可能包括：通過上調細胞周期相關蛋白CDK4和cyclin D1的表達促進腫瘤細胞的活力；通過上調胃癌細胞中AKT的磷酸化水平和抑制PTEN功能促進胃癌細胞的侵襲轉移；同時上調VEGF的表達水平，促進胃癌組織中的腫瘤血管生成，為胃癌的侵襲轉移提供必要的能量供應條件。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of transcription factor HOXB7 silencing on viability, invasion and migration of SGC-7901 cells

ZHANG Wei-li, CHEN Chao

(MedicalSchool,XinyangVocationalandTechnicalCollege,Xinyang464000,China.E-mail:zhangweilis@163.com)

AIM: To explore the effects of transcription factorHOXB7 silencing on the viability, invasion and migration of SGC-7901 cells. METHODS: The siRNA was designed to specifically interfere the expression ofHOXB7. To assess the silence efficiency of the siRNA, the expression of HOXB7 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot in the SGC-7901 cells transfected with siRNA. The cell viability was measured by MTT assay. Cell cycle-related proteins such as cyclin D1 and CDK4 were determined by Western blot. Transwell assay was performed to analyze the migration ability of the SGC-7901 cells. The mRNA and protein levels of the tumor invasion- and metastasis-related molecules, such as VEGF, PTEN and p-AKT, were also detected by real-time PCR and Western blot. RESULTS: The expression of HOXB7 at mRNA and protein levels was higher in the gastric carcinoma tissues than that in the normal gastric tissues. The expression of HOXB7 at mRNA and protein levels was knockdown by siRNA. After silencing ofHOXB7 gene expression, the viability of the SGC-7901 cells decreased, the expression of cyclin D1, CDK4 and VEGF was down-regulated, and the phosphorylation level of AKT was also obviously decreased. CONCLUSION: HOXB7 effectively promotes the viability, invasion and migration of gastric carcinoma cells by up-regulating the expression of cyclinD1, CDK4 and VEGF, and increasing the phosphorylation level of AKT to inhibit PTEN function.

HOXB7 gene; Gastric carcinoma; Cell viability; Cell invasion; Cell migration

1000- 4718(2016)10- 1824- 06

2016- 05- 13

2016- 07- 28

△通訊作者 Tel: 0376-6283606; E-mail： zhangweilis@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.014

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