重組大鼠CC16蛋白質對LPS誘導大鼠氣道上皮細胞表達TNF-α、IL-6和IL-8的影響*

龐 敏， 王 冬， 李 婷， 王 丹， 袁麗榮， 郭 民， 王海龍

(山西醫科大學 1第一醫院呼吸科， 2實驗動物中心， 3基礎醫學院， 山西 太原 030001)

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重組大鼠CC16蛋白質對LPS誘導大鼠氣道上皮細胞表達TNF-α、IL-6和IL-8的影響*

龐 敏1△， 王 冬1， 李 婷1， 王 丹1， 袁麗榮1， 郭 民2， 王海龍3

(山西醫科大學1第一醫院呼吸科，2實驗動物中心，3基礎醫學院， 山西 太原 030001)

目的： 觀察重組大鼠CC16蛋白質(rCC16)對脂多糖(LPS)誘導大鼠氣道上皮(RTE)細胞腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-8表達的影響及其可能機制。方法: 體外培養RTE細胞，以不同劑量(0.5、1.0和2.0 mg/L)的rCC16預處理RTE細胞2 h，接著加入0.1 mg/L的LPS繼續培養24 h。采用RT-qPCR測定各組細胞TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表達；采用ELISA測定細胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量；采用Western blot法分析核因子(NF)-κB p65在細胞核中的分布。結果: LPS刺激RTE細胞可以顯著上調TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA及蛋白水平的表達，給予不同劑量rCC16干預后，LPS誘導的上述炎癥介質的表達被抑制，且rCC16對IL-6和IL-8的抑制作用呈劑量依賴性，隨著rCC16劑量的增加，抑制作用增強；而對TNF-α的抑制則沒有劑量依賴關系。Western blot實驗結果顯示，rCC16可以抑制LPS誘導的NF-κB p65的核轉移，且有劑量依賴性。結論: rCC16可能通過NF-κB信號通路抑制LPS誘導的RTE細胞TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA及蛋白的表達。

CC16蛋白質； 氣道炎癥； 脂多糖； 炎癥因子； 核因子κB

克拉拉細胞蛋白16(Clara cell protein 16，CC16)主要由位于氣道上皮的Clara 細胞分泌合成，在支氣管肺泡灌洗液中含量最豐富，具有抗炎活性[1]。眾多臨床標本及動物模型研究發現，氣道CC16蛋白質含量的減少，是引起氣道炎癥如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和哮喘發生發展的重要因素[2-3]，因此補充CC16蛋白質被視為一種潛在的干預肺部炎癥的措施[4]。同時研究表明，炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)-6和IL-8在慢性氣道炎癥疾病發生發展中亦發揮關鍵作用，如TNF-α在炎癥發展初期可以促進肺上皮細胞合成嗜酸細胞活化趨化因子，后者參與哮喘的進程[5]； IL-6和IL-8促進中性粒細胞的募集并激活中性粒細胞釋放炎癥介質，加劇肺部炎癥的發展[6]。本文在前期實驗成功獲得重組大鼠CC16蛋白質(recombinant rat CC16 protein,rCC16)且確定其安全劑量的基礎上[7-8]，研究CC16對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激大鼠氣道上皮(rat tracheal epithelial，RTE)細胞后炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8表達的影響，并對其可能的機制進行初步研究。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

RTE細胞株(北京協和醫學院基礎所細胞中心)；rCC16由本實驗室制備，-70 ℃儲存；LPS(Sigma)；MEM-EBSS細胞培養液和胎牛血清(HyClone)；大鼠TNF-α、IL-6和IL-8酶聯免疫試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；TRIzol、RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq Kit(大連寶生物科技有限公司)；RIPA蛋白提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒和胞漿胞核蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific)；NF-κB p65抗體、GAPDH和histone H1抗體(Santa Cruz)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋科技有限公司)；其余試劑為國產分析純。3111型CO2培養箱(Thermo Scientific)；CKX41-A22PHP型倒置顯微鏡(Olympus)；UV-2602型紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)；PikoREAL實時定量熒光PCR儀(Thermo Scientific)；Epoch酶標儀(Biotek)；Tanon-2500R凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 將RTE細胞用含20%胎牛血清的MEM-EBSS培養液(內含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，3～4 d傳代1次。

2.2 實驗分組及處理 實驗分組為對照組、LPS組、LPS+rCC16(0.5 mg/L)、LPS+rCC16(1 mg/L)和LPS+rCC16(2 mg/L)組。將5×105RTE細胞接種于6孔板內，次日更換為無血清培養基，分別加入不同劑量的rCC16孵育2 h后，除對照組外，均加入0.1 mg/L 的LPS繼續培養24 h，分別收集培養液上清和細胞，進行細胞因子mRNA和蛋白質水平的檢測；對于NF-κB p65細胞核轉移的檢測，則在加入LPS后1 h 收集細胞。所有實驗重復3次。

2.3 RT-qPCR檢測TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表達 收集LPS刺激24 h的RTE細胞，加入 1 mL TRIzol裂解液，反復吹打至細胞充分裂解，按說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度后取1 μg按照試劑盒說明書進行逆轉錄及PCR擴增。PCR的擴增條件為95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個循環，將目的基因的Ct值用大鼠GAPDH的Ct值進行標準化，基因表達的相對倍數變化用比較閾值法(即2-ΔΔCt)表示。TNF-α的上游引物為5’-GAGATGTGGAACTGGCAGA-3’，下游引物為5’-GAGAACCTGGGAGTAGATAAGG-3’；IL-6的上游引物為5’-CAGTTGCCTTCTTGGGACT-3’，下游引物為5’-GCTCTGAATGACTCTGGCTT-3’；IL-8的上游引物為5’-CCCCCATGGTTCAGAAGATTG-3’，下游引物為5’-TTGTCAGAAGCCAGCGTTCAC-3’；GAPDH的上游引物為5’-GTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3’，下游引物為5’-CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG-3’。引物由中美泰和生物科技有限公司合成。

2.4 ELISA 檢測細胞培養上清液TNF-α、IL-6和IL-8的含量 實驗嚴格參照試劑盒說明書操作。

2.5 Western blot 實驗 收集LPS刺激1 h后的RTE細胞，分別按照RIPA和胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白、胞核蛋白及胞漿蛋白，BCA法定量后取30 μg蛋白進行Western blot檢測，蛋白條帶經X片曝光，凝膠成像分析后，目的蛋白的表達量以目的蛋白吸光度與內參照吸光度的比值表示。抗體稀釋比例為1∶1 000(NF-κB p65和histone H1)、1∶3 000 (GAPDH)和1∶5 000(辣根過氧化物酶標記的II抗)。

3 統計學處理

所有數據均采用以均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 13.0軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t檢驗進行統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 rCC16抑制LPS誘導RTE細胞中TNF-α、IL-6和IL-8 mRNA表達

為保證PCR擴增的特異性，我們首先檢測了TNF-α、IL-6和IL-8引物的熔解曲線，結果如圖1，各組引物僅出現單峰，說明引物具有特異性。

LPS刺激RTE細胞24 h后，TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA含量較對照組明顯升高(P<0.01)。給予不同劑量的rCC16干預后，IL-6和IL-8的mRNA含量較單純LPS組明顯降低，隨著rCC16 劑量的增加，對IL-6和IL-8的抑制作用增強，各干預劑量組與LPS組相比差異均有統計學顯著性(P<0.01)。TNF-α的mRNA含量在rCC16劑量為0.5 mg/L時就呈現明顯抑制作用(P<0.01)，隨著rCC16的劑量增加，這種抑制作用有所減弱，但含量仍較LPS組低(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The validity of melting curves of the primers for rat TNF-α (A), IL-6 (B) and IL-8 (C).

圖1 大鼠IL-6、IL-8和 TNF-α引物熔解曲線的檢測

Figure 2.The effect of rCC16 on LPS-stimulated mRNA expression of IL-6, IL-8 and TNF-α in the RTE cells was determined by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖2 RT-qPCR檢測rCC16對LPS誘導RTE細胞IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表達的影響

2 rCC16抑制LPS誘導RTE細胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8的表達

LPS刺激RTE細胞24 h后，細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-8的含量較對照組明顯升高(P<0.01)。給予不同劑量rCC16干預后，IL-6和IL-8的含量較單純LPS組明顯降低，且隨著rCC16 劑量增加，對IL-6和IL-8的抑制作用增強，具有劑量依賴性，各干預劑量組與LPS組相比差異均有統計學顯著性(P<0.01)。TNF-α的含量在rCC16劑量為0.5 mg/L時就呈現明顯抑制作用(P<0.01)，但隨著rCC16 劑量增加并未表現出抑制作用的增加，1 mg/L組的含量仍較LPS組低(P<0.05)，而2 mg/L組的含量與LPS組比較差異無統計學顯著性，見圖3。

3 rCC16抑制LPS誘導RTE中NF-κB p65的核轉移

LPS刺激RTE細胞1 h后，細胞核內NF-κB含量明顯增多，與空白對照組相比差異有統計學顯著性(P<0.01)。給予不同劑量rCC16干預后，細胞核內NF-κB含量較單純LPS組明顯降低，并具有劑量依賴性，且隨著rCC16 劑量增加，細胞核內NF-κB含量更少，與單純LPS組比較差異具有統計學顯著性(P<0.01)。而細胞漿中NF-κB的含量則正好相反，各組細胞中NF-κB總蛋白的含量未見改變，差異無統計學顯著性，見圖4。

Figure 3.The effects of rCC16 on LPS-stimulated protein expression of IL-6, IL-8 and TNF-α in the RTE cells detected by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖3 ELISA檢測rCC16對LPS誘導RTE細胞IL-6、IL-8和TNF-α表達的影響

Figure 4.The effect of rCC16 on LPS-induced NF-κB p65 nuclear translocation in the RTE cells was tested by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

圖4 rCC16對LPS誘導RTE細胞中NF-κB p65核轉移的影響

討 論

CC16蛋白是一種肺組織特異性的內源性抗炎因子，缺乏CC16的轉基因鼠肺部易受氧化劑、內毒素損傷，且炎癥反應增強[9]。在利用香煙煙霧制備的大鼠COPD模型中發現氣道炎癥出現時Clara細胞及其表達的CC16明顯減少，引起氣道抗炎能力下降，導致炎癥進一步惡化[10-11]。在炎癥的發生發展中，炎癥因子發揮了關鍵作用。促炎因子TNF-α和LPS可誘發上皮細胞IL-8的表達[12]，IL-8是一種化學趨化因子，對中性粒細胞有強烈的趨化和激活作用，在COPD和以中性粒細胞為主的炎癥性疾病中發揮重要作用；IL-6是一種多功能的細胞因子，可以募集并激活中性粒細胞釋放多種炎癥介質如花生四烯酸代謝產物、緩激肽和組織胺等參與炎癥反應[6]。進一步地，這些細胞因子還可相互作用形成許多正反饋通路，導致“炎癥級聯效應”的發生，使炎癥反應持續和加重[13]。因此，降低炎癥因子的表達已經成為治療炎癥性疾病的有效選擇。

前期研究顯示，rCC16可以降低LPS誘導的RTE細胞中基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotei-nase，MMP)-9的表達[8]，描繪出rCC16潛在的應用價值。眾所周知，氣道上皮細胞除了機械屏障作用外，還有更重要的免疫炎癥防御作用，可產生許多炎癥介質，募集炎性細胞，誘發異常的炎癥反應，造成病理損傷[14]。本研究顯示，rCC16可以有效地降低LPS誘導的RTE細胞中TNF-α、IL-6和IL-8的表達，進一步證明CC16蛋白質的抗炎活性及應用潛力。

NF-κB是炎癥和免疫反應中的關鍵轉錄因子，通常的存在形式是由p65與p50兩個亞單位組成異二聚體并與其抑制物IκB結合而停留在細胞漿中。受到細胞內外刺激時IκB磷酸化并與NF-κB脫離，NF-κB憑借核定位信號進入細胞核，與靶基因特異的結合位點結合并激活該基因轉錄[15]。研究顯示TNF-α、IL-6和IL-8受NF-κB信號通路活化而調控[16]，為明確rCC16抑制上述炎癥因子產生的分子機制，我們檢測了rCC16對NF-κB/p65在LPS刺激下核定位的變化，結果發現rCC16可以顯著抑制LPS誘導的NF-κB/p65的核轉移，這就說明了rCC16是通過NF-κB信號通路抑制LPS誘導TNF-α、IL-6和IL-8的表達。

本研究中發現rCC16對LPS誘導的IL-6和IL-8的抑制作用具有劑量依賴性，而對TNF-α的抑制作用反而在高劑量下有所減弱，這種現象的具體機制還有待進一步研究，分析原因可能與TNF-α本身的復雜性有關。TNF-α可被其它促炎因子刺激而生成，同時它本身也是很強的促炎劑，它的增高可激活多條炎癥信號通路并誘導其它炎癥介質的生成。Shashikant 等[17]利用不同劑量的重組人CC16蛋白質聯合表面活性劑治療早產羊呼吸窘迫綜合征模型，發現兩者聯合治療與單純表面活性劑治療相比可降低血漿和肺內IL-6、IL-8和TNF-α的含量，但在最佳劑量方面各炎癥介質亦有所差別，這與本研究中的結果具有一致性。

綜上所述，本研究顯示rCC16可抑制LPS引起的RTE細胞TNF-α、IL-6和IL-8的表達，這種抑制作用是通過抑制LPS誘導的NF-κB的活化而實現的。這就為肺部炎癥性疾病的發病機制研究和藥物治療提供了新的思路。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of recombinant rat CC16 protein on LPS-induced expression of TNF-α, IL-6 and IL-8 in rat tracheal epithelial cells

PANG Min1, WANG Dong1, LI Ting1, WANG Dan1, YUAN Li-rong1, GUO Min2, WANG Hai-long3

(1DepartmentofRespiration,TheFirstHospital,2CenterofLaboratoryAnimal,3CollegeofBasicMedicine,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:pangmin2009@126.com)

AIM: To explore the effect of recombinamt rat CC16 protein (rCC16) on LPS-induced expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-8 in the rat tracheal epithelial (RTE) cells. METHODS: The RTE cells were incubated with rCC16 at concentrations of 0.5, 1.0 and 2.0 mg/L in serum-free media for 2 h prior to LPS (0.1 mg/L) treatment for further 24 h. The cells were harvested for assessing the mRNA levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 by RT-qPCR. The cell culture supernatants were collected for analyzing the protein levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 by ELISA. In addition, the nuclear translocation of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 was tested by Western blot.RESULTS: rCC16 inhibited LPS-induced IL-6 and IL-8 expression at both mRNA and protein levels in the RTE cells in a concentration-dependent (0～2 mg/L) manner, as demonstrated by RT-qPCR and ELISA. However, no concentration-dependent manner between the dose of rCC16 and TNF-α expression was observed, and rCC16 inhibited LPS-induced TNF-α expression at lower concentration (0.5 mg/L). rCC16 concentration-dependently inhibited the effects of LPS on the level of nuclear translocation of NF-κB p65.CONCLUSION: rCC16 suppresses LPS-mediated TNF-α, IL-6 and IL-8 production through inactivation of NF-κB activity in RTE cells.

CC16 protein; Airway inflammation; LPS; Inflammatory mediators; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2016)10- 1843- 05

2016- 05- 30

2016- 06- 20

山西省回國留學人員科研資助項目(No. 2015-101)；山西省留學回國人員科技活動擇優資助項目(No. 2016-097)；山西醫科大學博士啟動基金(No. 03201539)

△通訊作者 Tel: 0351-4639903; E-mail: pangmin2009@126.com

R363; R563.19

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.017

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