高原紅細胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達的相關性*

劉 芳， 魏 巍， 冀林華， 馮婷婷， 王樹林， 施繼禹

(青海大學 1醫學院生物化學教研室， 2附屬醫院血液科，青海 西寧 810001)

?

高原紅細胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達的相關性*

劉 芳1△， 魏 巍2， 冀林華2， 馮婷婷2， 王樹林1， 施繼禹1

(青海大學1醫學院生物化學教研室，2附屬醫院血液科，青海 西寧 810001)

目的： 探討高原紅細胞增多癥(HAPC)模型大鼠骨髓CD71+細胞轉錄因子GATA-1和GATA-2表達的相關性。方法: 雄性SD大鼠48只，隨機分為對照組和HAPC模型組。在海拔4 300 m自然環境下復制HAPC模型并采用骨髓涂片、骨髓細胞分類計數和血液學參數檢測進行驗證。流式細胞術檢測骨髓CD71+細胞數量相對變化趨勢；RT-qPCR和Western blot法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達變化，低氧培養CD71+細胞，篩選最佳干擾序列GATA-1 shRNA1后，轉染96 h，RT-qPCR和Western blot法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達水平。結果: 骨髓細胞分類計數、涂片及血液學參數檢測結果顯示，HAPC大鼠模型復制成功。與對照組比較，HAPC模型組骨髓CD71+細胞明顯增多，骨髓CD71+細胞GATA-1 的mRNA和蛋白表達增高，GATA-2的mRNA和蛋白表達差異無統計學顯著性。對照組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達呈負相關，HAPC模型組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達無顯著相關性。GATA-1 shRNA1干擾96 h后，GATA-1的mRNA和蛋白表達低于對照組，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達變化差異無統計學顯著性。結論: HAPC大鼠骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達異常，兩者的負相關關系改變可能是導致HAPC發生的機制之一。

高原紅細胞增多癥； 轉錄因子； GATA-1； GATA-2

成熟紅細胞執行生物體內氧氣運輸功能。其產生經歷造血干細胞至紅系祖細胞的早期分化階段和紅系祖細胞至成熟紅細胞的終末分化階段，是眾多轉錄因子參與的多步驟有序調控過程。這些轉錄因子為階段性表達，它們既相互作用又呈現其特異性。GATA家族是具有保守鋅指結構域的轉錄因子，能夠特異地結合基因啟動子區的(A/T)GATA(A/G)序列[1-2]，調控下游基因的轉錄活性，參與造血、神經等不同系統的發育。GATA-2和GATA-1同屬于GATA家族，是紅細胞生成不可或缺的轉錄因子。GATA-2表達于造血干/祖細胞，調控紅系祖細胞增殖；GATA-1在紅系細胞中高表達，調控紅系終末分化[3-4]。當GATA-2和GATA-1自身表達異常時，會嚴重干擾乃至完全破壞紅系的正常發育和分化，導致一系列血液疾病的發生。

高原紅細胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是慢性高原病最常見的一種臨床類型，該疾病以紅細胞過度積累、嚴重低氧血癥為特征，常并發心腦血管意外，肺栓塞，缺血、缺氧性腎病及胃腸病等多種致死率較高的嚴重疾病，對高原地區人群的身心健康構成嚴重危害[5]，但迄今仍未能闡明該疾病的治病機理。因為轉鐵蛋白受體CD71是紅系細胞表面的特異性標志物之一，它表達于紅系祖細胞至網織紅細胞的各分化階段[6]，故本研究以HAPC模型大鼠骨髓CD71+細胞為材料，分析GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達水平變化及其相關性，為闡釋HAPC的發病機制提供新的科學實驗依據。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

健康SPF級雄性SD大鼠48只，體重(200±20)g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK(陜) 2012-003，合格證號為61001700000509。

大鼠骨髓單個核細胞分離試劑盒購自TBD；Anti-PE MicroBeads購自Miltenyi；單克隆抗體PE-CD71和PE-IgG2a購自BD；GATA-1 shRNA靶點設計，慢病毒載體構建及包裝由上海吉凱基因技術公司完成；StemSpanTMSFEMⅡ購自STEMCELL；小鼠抗大鼠GATA-1、β-actin單克隆抗體和兔抗大鼠GATA-2多克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標記的 II 抗IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas；SYBR Green PCR Master Mix購自Bio-Rad；所用引物(表1)均由上海生工生物工程股份有限公司合成。其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。

表1 引物序列

2 方法

2.1 動物分組及HAPC模型的建立 實驗動物隨機分為對照組(海拔2 250 m)和HAPC模型組(海拔4 300 m)，每組24只。依據文獻報道[7]，HAPC組模型大鼠自西安交通大學醫學部運至海拔4 300 m的青海省玉樹州珍琴鄉飼養40 d。同期對照組在海拔2 250 m的西寧市飼養。經尾靜脈采血，測定紅細胞數(erythrocyte count，RBC)、血紅蛋白量(hemoglobin，Hb)、紅細胞壓積(haematocrit，HCT)；經頸動脈插管取血行動脈血氣分析，檢測動脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)；骨髓涂片后進行病理檢測和細胞計數。根據2004年第六屆國際高原醫學和低氧生理學術大會制訂的慢性高原病青海診斷標準(Hb>210 g/L，HCT>65%)判斷動物是否患有HAPC[8]。

2.2 CD71+細胞的流式細胞術檢測和分選 分離大鼠骨髓單個核細胞，分為4組。其中2組分別加入PE-CD71抗體和同型對照抗體4 ℃孵育30 min，檢測細胞CD71抗體的平均熒光強度值(mean fluorescence intensity，MFI)；另外2組分別與PE-CD71抗體和同型對照抗體4 ℃避光反應10 min后，加入Anti-PE MicroBeads 4 ℃避光孵育15 min，上樣分選柱分選CD71+細胞，檢測細胞CD71抗體的MFI。細胞計數10 000個以上。

2.3 RT-qPCR和Western blot實驗檢測GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達 提取CD71+細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后，以β-actin為內參照，采用 2-ΔΔCt方法檢測GATA-1和GATA-2的mRNA表達。設置擴增參數為95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s，40個循環。每個樣本重復3次。RIPA裂解液提取CD71+細胞總蛋白，BCA法定量后進行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h， I 抗GATA-1(1∶600)和GATA-2(1∶800)4 ℃過夜， II 抗(1∶80 000)室溫下孵育1 h，ECL發光壓片顯色。以β-actin 為內參照。

2.4 CD71+細胞的低氧培養 HAPC模型組CD71+細胞重懸于StemSpanTMSFEMⅡ中，調整6孔板細胞接種量為每孔1.5×106，置37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的飽和濕度低氧培養箱中培養12 h，進行后續RNA干擾實驗。

2.5 細胞轉染 低氧培養的CD71+細胞分為5組：空白對照組、陰性對照組及GATA-1 shRNA(1、2、3)組， 每組5個復孔。干擾序列GATA-1 shRNA1為5’-GGTGCTGAACCTTCTGCATCA-3’；GATA-1 shRNA2為5’- GGGAAGAACAACAATACATTC-3’；GATA-1 shRNA3為5’-GGCCCAAGAAGCGAATGATTG-3’；陰性對照序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。按復感染指數MOI=2加入GATA-1 shRNA慢病毒液，96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測轉染后GATA-1的mRNA及蛋白表達，篩選出最佳干擾序列。轉染最佳干擾序列96 h后，觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達。

3 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，實驗數據進行Shapiro-Wilk檢驗，符合正態分布的實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，采用Bonferroni檢驗。不符合正態分布的實驗數據以中位數(下四分位數，上四分位數)[median (Q1,Q3)]表示，差異顯著性采用秩和檢驗。相關性分析采用Pearson相關檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 骨髓細胞形態特征、分類計數和血液學參數的比較

骨髓涂片結果顯示HAPC模型組變形紅細胞較對照組增多，可見棘球狀、小球形、大球形等異常紅細胞(圖1)。與對照組的骨髓粒、紅細胞系分類計數結果比較，HAPC模型組的中、晚幼紅細胞明顯增加(P<0.05)；粒細胞系統與有核紅細胞的比值減低(P<0.05)，粒細胞系統兩組差異無統計學顯著性，見表2、3；血液學參數檢測結果提示RBC、Hb和HCT升高，SaO2降低(P<0.05)，見表4。

Figure 1.The morphology of bone marrow cells in 2 groups (×400). A: control group, the red arrows point to the normal RBCs; B: HAPC group, the yellow arrows point to the abnormal RBCs.

圖1 兩組骨髓細胞形態學的比較

表2 兩組骨髓粒、紅細胞系分類計數比較

Table 2.The comparison of myeloid cells differential count in both groups (n=24)

GroupGranulocyticseriesErythrocyticseriesGranulocyte/erythrocyteControl0．50(0．00，8．38)3．25(1．00，10．25)2．88±0．40HAPC0．00(0．00，5．50)9．00(0．63，20．38)?1．27±0．67?

*P<0.05vscontrol group.

表3 兩組紅細胞系統分類計數比較

Table 3.The comparison of erythroid cells differential count in both groups (n=24)

GroupMacroblastBasophilicnormoblastIntermediateerythroblastAcidophilicnormoblastControl0．00(0．00，0．50)1．44±0．689．69±2．409．38±3．67HAPC0．25(0．00，1．00)3．25±2．6317．38±7．15?18．94±7．82?

*P<0.05vscontrol group.

表4 血液學參數檢測結果

Table 4.The test results of hematologic parameters (Mean±SD.n=24)

GroupRBC(×1012/L)Hb(g/L)HCT(%)SaO2(%)Control8．25±0．19187．54±7．1654．62±2．4396．23±1．15HAPC11．12±0．26?253．26±13．52?76．40±2．78?74．88±2．86?

*P<0.05vscontrol group.

2 骨髓細胞CD71的MFI

分選后兩組CD71+細胞的純度均達到90%以上；HAPC模型組MNC中CD71抗體的MFI明顯高于對照組(P<0.05)，見表5、圖2。

3 骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 mRNA及蛋白的表達變化

與對照組比較，HAPC模型組CD71+細胞GATA-1的mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)，GATA-2的mRNA及蛋白的表達量在兩組間差異無統計學顯著性，見圖3、4。

表5 CD71+細胞的分選結果

Table 5.The separation results of CD71+cells (Mean±SD.n=24)

GroupPercentageinmononuclearcells(%)Puritycoefficient Control25．05±3．3292．90±1．81 HAPC53．48±3．81?92．10±2．13

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2.CD71 MFI in HAPC group and the corresponding FCM hisgrams. A: MFI of CD71 in HAPC group; B: the images of CD71 detected by flow cytometry. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖2 HAPC模型組CD71的MFI及流式細胞術直方圖

Figure 3.The mRNA expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖3 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA表達

Figure 4.The protein expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖4 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 蛋白的表達

4 骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的相關性分析

相關性分析顯示HAPC模型組CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達無顯著相關性，相關系數分別為-0.143和0.357；對照組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達呈負相關，相關系數分別為-0.828和-0.931(P<0.01)。

5 GATA-1 shRNA干擾效率的驗證

與陰性對照組相比，各GATA-1 shRNA組GATA-1的mRNA和蛋白表達量差異有統計學顯著性(P<0.05)。其中，GATA-1 shRNA1的干擾效果最好，后續實驗選擇GATA-1 shRNA1序列進行轉染，見圖5。

6 GATA-1 shRNA1對GATA-2表達的影響

熒光倒置顯微鏡下，GATA-1shRNA1組綠色熒光分布于細胞內，與光學顯微鏡下同一視野對比，70%以上細胞顯示綠色熒光(圖6)； 在GATA-1 shRNA1干擾作用下，GATA-1的mRNA和蛋白表達量低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達量并無減低，見圖7。

Figure 5.The screening results ofGATA-1 shRNA interference sequences in CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖5 GATA-1 shRNA干擾序列篩選結果

Figure 6.The fluorescence observation of the CD71+cells tranfected withGATA-1 shRNA1 for 96 h (×200). A: fluorescence microscopy; B: bright field microscopy.

圖6 GATA-1 shRNA1轉染96 h后的熒光顯微鏡觀察

Figure 7.The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels after GATA-1 RNAi transfection in the CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖7 HAPC模型組骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2 mRNA和蛋白的表達

討 論

GATA-2和GATA-1參與紅系造血調控。GATA-2維持著造血干/祖細胞增殖和自我更新，其表達下調影響造血干/祖細胞的分化[9-10]。在紅系分化的不同時期，GATA-1的表達量和生物學功能是動態變化的[11]。它在紅系和巨核系祖細胞時期的表達量處于較低水平，分化到紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid, CFU-E)和原紅細胞時其表達量幾乎達到頂峰，此后表達量緩慢下降。GATA-1發揮著下調GATA-2等細胞增殖分裂基因[12-13]、上調眾多紅系特異性基因[14-15]等作用。隨著正常紅系分化的推進，GATA-1表達增加且抑制GATA-2基因的表達，兩者共同作用，協同其它因子調控造血干/祖細胞向紅系終末分化轉折[12]。那么，GATA-1和GATA-2表達及作用關系異常勢必會影響紅系細胞的正常發育，終將導致紅細胞系統疾病的發生。依據文獻報道復制HAPC大鼠動物模型，應用骨髓涂片、骨髓細胞分類計數和血液學參數檢測進行驗證。骨髓細胞形態學結果顯示，HAPC模型的骨髓未成熟紅細胞明顯增多，尤以變形紅細胞最為突顯；細胞分類計數后，發現中、晚幼紅細胞明顯增加，粒細胞系統與有核紅細胞的比值明顯降低；血液學參數指標Hb和HCT明顯高于慢性高原病青海診斷標準，但是SaO2降低顯著，說明紅細胞數量明顯增多，但是其攜氧能力下降顯著，提示HAPC動物模型復制成功。

采用流式細胞術對CD71+細胞的純度和占MNC的比例進行檢測可見HAPC模型組的CD71抗體MFI明顯高于對照組，同時兩組CD71+細胞的純度均可達到90%以上，提示HAPC模型組骨髓髓系造血干/祖細胞向紅系細胞分化明顯增加，而且細胞免疫磁珠分選法可以獲得高純度的CD71+細胞，這為下一步的RT-qPCR和Western blot實驗檢測工作奠定了基礎。

RT-qPCR和Western blot實驗檢測GATA-1和GATA-2表達的結果顯示，HAPC模型組CD71+細胞GATA-1的mRNA及蛋白表達明顯升高，GATA-2的mRNA及蛋白的表達量未降低，提示高原低氧刺激下，GATA-2表達量保持不變，可能有益于它發揮增殖造血干/祖細胞，擴充造血祖細胞池的作用；同時GATA-1表達增高，有利于加強它對眾多紅系特異性靶基因的調節，促進紅系細胞分化。GATA-1與GATA-2間的相關性分析表明，對照組GATA-1和GATA-2呈負相關關系，但是HAPC模型組中上述因子間無明顯相關性。進一步采用小RNA干擾技術抑制HAPC模型組CD71+細胞GATA-1表達后，發現GATA- 2的表達未被抑制。提示高原低氧條件下，GATA-1與GATA-2間的相關關系發生改變，這可能促使了骨髓紅系細胞的過度增殖和大量分化，最終導致成熟紅細胞的過度積聚。但是高原低氧時，GATA-2的表達未被GATA-1抑制，是因為抑制作用減弱，還是有它途徑加強GATA-2的表達而部分抵消GATA-1對它的抑制作用，原因尚未知曉。在后繼研究中，本課題組將繼續探尋其中的因果。

綜上所述，本研究復制HAPC大鼠模型后，分析比較兩組GATA-1和GATA-2的表達情況和相關關系，提示HAPC模型骨髓CD71+細胞GATA-1和GATA-2表達異常，兩者的負相關關系削弱，這可能促進了HAPC的發生發展。

[1] 徐 令，陳 小，賴文玉，等. 轉錄因子GATA2在TNF-α介導的炎癥反應中調節Tie2基因的表達[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(6):1198-1202.

[2] 田可港，浮 苗，高 艷，等. 轉錄因子GATA-1與人巨細胞病毒UL111A基因5’上游序列結合的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(12):2244-2249.

[3] Harigae H. GATA transcription factors and hematological diseases[J]. Tohoku J Exp Med, 2006, 210(1):1-9．

[4] Kaneko H, Shimizu R, Yamamoto M. GATA factor swit-ching during erythroid differentiation[J]. Curr Opin Hematol, 2010, 17(3):163-168．

[5] 沈永勤，賈守寧. 防治高原紅細胞增多癥用藥規律分析[J]. 青海醫藥雜志, 2010, 40(2):67-68.

[6] Derek K, Geraldine S, Hongbo Y. CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens[J]. Am J Clin Pathol, 2010, 134(3):429-435.

[7] 靳國恩，韻海霞，馬 蘭，等. 高原紅細胞增多癥動物模型的建立及其生理功能反應[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2009, 24(13): 4713-4716.

[8] 中華醫學會高原醫學分會. 關于統一使用慢性高原(山)病“青海標準”的決定[J]. 高原醫學雜志, 2007, 17(1): 1-2.

[9] Tsai FY, Keller G, Kuo FC, et al. An early haematopoietic defect in mice lacking the transcription factor GATA- 2[J]. Nature, 1994, 371(6494):221-226.

[10]Tsai FY, Orkin SH. Transcription factor GATA-2 is required for proliferation/survival of early hematopoietic cells and mast cell formation, but not for erythroid and myeloid terminal differentiation[J]. Blood, 1997, 89(10):3636-3643.

[11]Scherzer CR, Grass JA, Liao Z, et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene alpha-synuclein[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(31):10907-10912.

[12]Hong W, Nakazawa M, Chen YY, et al. FOG-1 recruits the NuRD repressor complex to mediate transcriptional repression by GATA-1[J]. EMBO J, 2005, 24(13):2367-2378.

[13]Rylski M, Welch JJ, Chen YY, et al. GATA-1-mediated proliferation arrest during erythroid maturation[J]. Mol Cell Biol, 2003, 23(14):5031-5042.

[14]Woon KY, Kim S, Geun KC, et al. The distinctive roles of erythroid specific activator GATA-1 and NF-E2 in transcription of the human fetal gamma-globin genes[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(16):6944-6955.

[15]Magawa S, Suzuki N, Ohmine K, et al. GATA suppresses erythropoietin gene expression through GATA site in mouse erythropoietin gene promoter[J]. Int J Hematol, 2002, 75(4):376-381.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression relevance of GATA-1 and GATA-2 in bone marrow CD71+cells of high-altitude polycythemia rat model

LIU Fang1, WEI Wei2, JI Lin-hua2, FENG Ting-ting2, WANG Shu-lin1, SHI Ji-yu1

(1DepartmentofBiochemistry,MedicalCollege,2DepartmentofHematology,AffiliatedHospital，QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:qhxnlf2006@163.com)

AIM: To investigate the expression relevance of transcription factors GATA-1 and GATA-2 in the bone marrow CD71+cells of a high-altitude polycythemia (HAPC) rat model.METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly divided into normal control group and HAPC model group. HAPC model was established at an altitude of 4 300 m in the natural environment and verified by the morphology and quantity of the bone marrow cells and hematologic parameters detection. A relative change in the trend of bone marrow CD71+cell numbers was detected by flow cytometry analysis. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels in the CD71+cells was examined by RT-qPCR and Western blot. CD71+cells were cultured under hypoxic condition and transfected with the optimal interference sequence of GATA-1shRNA1 for 96 h. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot.RESULTS: The establishment of the animal model with HAPC was successful as the bone marrow smears and the hematologic parameters showed compared with the control. The quantity of the bone marrow CD71+cells of HAPC rats were significantly increased and the expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in the CD71+cells were higher than those of the control. The expression of GATA-2 at mRNA and protein levels was similar to that of the control. The correlation analysis showed that the expression of GATA-1 was negatively correlated with that of GATA-2 in the control, while no obvious correlation between them was observed in the HAPC rats. The expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in HAPC group was lower than that in control group after interfered byGATA-1 shRNA1 for 96 h, but no obvious diversity of GATA-2 expression between the 2 groups was observed.CONCLUSION: GATA-1 and GATA-2 are abnormally expressed and their negative correlation is destroyed in HAPC, which may be one of the pathogenesis of HAPC.

High-altitude polycythemia; Transcription factors; GATA-1; GATA-2

1000- 4718(2016)10- 1863- 07

2016- 01- 21

2016- 08- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81441116)；青海省科技廳(應用)基礎研究計劃項目(No. 2012-Z-729)；青海大學“123高層次人才培養工程”中青年學術帶頭人基金；青海大學醫學院中青年科研基金團隊項目(No. 2014-KT-1)

△通訊作者 Tel: 0971-6176859; E-mail: qhxnlf2006@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.020

雜志網址： http://www.cjpp.net