CIP2A過表達對胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡的影響

張海云， 常香榮

(陜西省康復醫院消化內科， 陜西 西安 710065)

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CIP2A過表達對胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡的影響

張海云， 常香榮△

(陜西省康復醫院消化內科， 陜西 西安 710065)

目的： 探究蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)過表達對胃黏膜上皮細胞GES-1增殖和凋亡的影響。方法: RT-qPCR檢測正常胃黏膜組織和胃息肉組織中CIP2A和cyclin D1的表達。將胃黏膜上皮GES-1細胞分為空白對照組、空載體對照組和CIP2A過表達組，分組感染GES-1細胞后，分別用MTT法和BrdU試劑盒檢測細胞增殖能力，流式細胞術檢測細胞的凋亡情況，Western blot法和RT-qPCR檢測凋亡蛋白的表達，ELISA檢測細胞培養上清炎性因子的濃度。用E2F1 siRNA轉染細胞，檢測各組細胞中p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平。結果: 與正常胃黏膜組織相比，腺瘤性胃息肉組織中CIP2A和cyclin D1的mRNA表達水平均明顯升高，而增生性胃息肉中CIP2A和cyclin D1的水平并無明顯變化。GES-1細胞感染CIP2A過表達重組腺病毒之后，細胞的增殖能力和細胞活力提高，細胞凋亡率降低，炎性因子IL-1β和IL-10分泌增加，p-Rb、E2F1和cyclin D1蛋白水平升高，而E2F1沉默降低p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平。結論: CIP2A通過激活Rb/E2F1促進GES-1細胞的增殖并抑制凋亡。

蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子; 細胞增殖; 細胞凋亡

胃息肉起源于胃黏膜或黏膜下層，是突出于胃腔的良性隆起性病變，可分為增生性息肉和腺瘤性息肉，其中腺瘤性息肉具有潛在的惡變傾向[1]。胃息肉的發生與幽門螺桿菌的感染以及胃黏膜損傷密切相關[2]。蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)是新發現的一種致癌因子，可通過抑制c-Myc蛋白水解，穩定c-Myc蛋白的表達水平，促進細胞增殖[3]。近年來，許多研究表明，胃息肉是胃癌發生過程中的重要環節，然而胃息肉惡變的發生機制還尚未有明確的報道。因此，本文通過檢測CIP2A在腺瘤性胃息肉中的異常表達，進一步探究其過表達對胃黏膜上皮細胞GES-1的細胞增殖、細胞凋亡、炎性因子、p-Rb/E2F1表達等的影響，旨在研究CIP2A過表達對胃黏膜上皮細胞增殖和凋亡的影響及其相關機制。

材 料 和 方 法

1 材料

胃黏膜上皮細胞GES-1，購自中國科學院上海細胞庫。重組腺病毒(Ad-emp和Ad-CIP2A)由本實驗室參考文獻構建并擴增[4]。E2F1 siRNA(上海生工生物工程公司)；RPMI-1640培養基(Gibco)；胎牛血清(Gemini)；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、BrdU細胞增殖試劑盒、抗CIP2A、p-Rb、E2F1和cyclin D1多克隆抗體(Sigma)；BCA試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天)。流式細胞儀(BD)；Tanon EPS-300電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 正常胃黏膜以及胃息肉組織的選取 標本取自2012年9月至2014年3月陜西省康復醫院消化內科60例，分為腺瘤性息肉組20例，其中男性4例，女性16例，年齡43～51歲；增生性息肉組20例，其中男性12例，女性8例，年齡31～45歲；正常胃黏膜組20例，其中男性7例，女性13例，年齡32～48歲(均以腹脹、中上腹不適為主要癥狀就診，就診4周內均未服用質子泵抑制劑、非甾體類抗炎藥，無飲酒史)；組織均置于-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。

2.2 胃黏膜上皮細胞的培養及感染 胃黏膜上皮細胞GES-1置于37 ℃、5% CO2培養箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基常規培養。將GES-1細胞以1×104/cm2接種于24孔培養板中(內含有玻片)培養。將細胞分為3組，空白對照組(control組)、陰性對照組(Ad-emp組)和CIP2A過表達組(Ad-CIP2A組)。次日，按分組感染細胞(感染復數MOI=100，病毒滴度均約為2×1010PFU/L)，將細胞培養液更換為不含雙抗的RPMI 1640培養液。完成操作后置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h，觀察細胞感染情況。

2.3 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達 TRIzol法分別提取正常胃黏膜和胃息肉組織的總RNA，并檢測其純度以及完整性。參照逆轉錄試劑盒說明書生成cDNA，擴增cDNA，CIP2A和cyclin D1擴增成功后，CIP2A和cyclin D1的mRNA水平采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)進行定量分析。引物由上海生工生物工程公司合成。

取對數生長期的GES-1細胞，分為control組、Ad-emp組、Ad-CIP2A組和Ad-CIP2A+E2F1 siRNA 組，按分組轉染細胞，培養48 h后，TRIzol法提取細胞總RNA，按照上述方法分析p-Rb、E2F1和cyclin D1的mRNA表達水平。

2.4 MTT法檢測細胞活力 按實驗分組感染細胞，培養48 h后，將細胞以每孔5×103個接種至96孔板內，24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩后，酶標儀檢測490 nm處吸光度值(A490)。

2.5 BrdU實驗檢測細胞增殖 按實驗分組感染細胞，培養48 h后，將細胞以每孔5×103個接種至96孔板內，24 h后進行BrdU檢測。按照BrdU細胞增殖檢測試劑盒檢測的步驟進行操作。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 按實驗分組感染細胞，培養48 h后收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒參照說明書操作，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

2.7 ELISA檢測培養上清液細胞炎性因子的含量 按實驗分組感染細胞，48 h后收集細胞，吸取培養上清液用于細胞因子的測定，按照ELISA試劑盒操作步驟，測定培養上清液中IL-1β和IL-10的水平。

2.8 免疫蛋白印跡法檢測cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2和Bax的蛋白水平 按實驗分組感染細胞，48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，4 ℃下用抗cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、p-Rb、E2F1和cyclinD1的 I 抗(均為1∶300)孵育過夜，PBST洗膜3次，II 抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用ECL發光液在暗室曝光并壓片。

3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料結果用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腺瘤性胃息肉組織中CIP2A與cyclin D1的mRNA表達上調

RT-qPCR結果顯示，與正常胃黏膜相比，增生性胃息肉組織中的CIP2A與細胞周期蛋白cyclin D1的mRNA水平差異并無統計學顯著性，而腺瘤性息肉組織中CIP2A與cyclin D1的水平均顯著上升(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CIP2A (A) and cyclin D1 (B) in the tissues of normal gastric mucosa, hyperplastic gastric polyps (HGPs) and adenomatous gastric polyps (AGPs). Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol.

圖1 正常胃黏膜、增生性胃息肉和腺瘤性胃息肉組織中CIP2A與cyclin D1的mRNA水平

2 CIP2A過表達促進GES-1細胞增殖

經腺病毒感染細胞后，與空白對照組比較，過表達組細胞CIP2A的mRNA表達量增加(6.51±0.17)倍，而陰性對照組細胞CIP2A的mRNA表達量無明顯改變。RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達顯著提高了細胞中周期蛋白cyclin D1的mRNA表達。MTT實驗結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達組的細胞活力明顯上升。BrdU實驗結果與MTT實驗結果一致。結果表明CIP2A過表達促進GES-1細胞的增殖(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The viability of the GES-1 cells after transfected with CIP2A. A, B: the relative mRNA expression levels; C: the results of MTT assay; D: the results of BrdU assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 CIP2A過表達對GES-1細胞增殖的影響

3 CIP2A過表達抑制GES-1細胞凋亡

流式細胞術的檢測結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達使GES-1細胞的凋亡率明顯降低，Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達顯著降低了細胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平，并且升高了Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。結果表明，CIP2A過表達抑制GES-1細胞凋亡,見圖3。

Figure 3.The apoptosis of the GES-1 cells after transfected with CIP2A. A： apoptosis detected by flow cytometry; B: apoptosis-rela-ted protein expression detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3 CIP2A過表達對GES-1細胞凋亡的影響

4 CIP2A過表達促進GES-1細胞中炎性因子的分泌

ELISA結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達使GES-1細胞培養上清中的IL-1β和IL-10含量顯著上升(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The levels of inflammatory cytokines in the culture supernatants of the GES-1 cells transfected with CIP2A. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖4 CIP2A過表達對GES-1細胞中炎性因子的影響

5 CIP2A過表達促進Rb/E2F1通路相關分子的表達

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，CIP2A過表達使GES-1細胞內p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平都顯著上升。而用E2F1 siRNA轉染細胞之后，p-Rb、E2F1和cyclin D1的蛋白水平又顯著降低(P<0.01)。RT-qPCR結果與Western blot實驗結果一致,表明CIP2A可能通過激活Rb/E2F1通路調節GES-1細胞的增殖和凋亡，見圖5。

討 論

胃息肉是胃癌的癌前疾病之一，其中腺瘤性息肉較增生性息肉有較高的癌變率[5]。目前的研究認為，胃黏膜長期慢性炎癥是腺瘤性胃息肉常發生的基礎，炎癥引起的細胞增殖與凋亡平衡的失調是腺瘤性胃息肉發展、惡變的重要原因。CIP2A是一種新近發現的蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的內源性抑制劑[6]。CIP2A通過增強c-Myc的穩定性，抑制體內PP2A的抑癌作用，導致細胞轉化和腫瘤生長[3]。有研究表明CIP2A蛋白在慢性萎縮性胃炎、胃癌組織中的陽性表達率均高于正常胃黏膜[7]，但其是否在胃息肉惡變中發揮作用尚未有明確報道。本研究結果證明，與正常胃黏膜組織相比，增生性胃息肉組織中CIP2A表達并無顯著差異，而腺瘤性胃息肉組織中的CIP2A mRNA水平顯著上升，表明CIP2A可能在胃息肉癌變過程中起了重要的作用。

Figure 5.The effect of CIP2A on the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 in the GES-1 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-CIP2A group.

圖5 CIP2A過表達對GES-1細胞p-Rb、E2F1和cyclinD1蛋白水平的影響

在多種人類惡性腫瘤中CIP2A均呈現高表達[8-9]，與腫瘤細胞的增殖凋亡密切相關[10]。有研究證明，CIP2A基因的沉默使喉癌Hep-2細胞生長曲線平坦，增殖指數降低，并且將細胞周期阻滯在G1期。另外，CIP2A被發現在白血病中過表達，并促進人原髓白血病細胞HL60的增殖和分化[11]。本研究結果證明，CIP2A過表達的GES-1細胞增殖活性明顯上升，細胞早期凋亡率與晚期凋亡率均顯著降低。Cyclin D1作為細胞周期調節蛋白，可控制細胞周期素依賴激酶對蛋白磷酸化作用的能力，從而加速細胞G1-S期進程。研究證明，隨著胃黏膜病理變化的加重，cyclin D1的表達逐漸上調[12-13]。正是cyclin D1的過度表達促使細胞過度增殖，進而使細胞增殖失控從而發生惡變。本研究結果證明，與正常胃黏膜組織相比，腺瘤性胃息肉組織中cyclin D1表達顯著上升。

胃黏膜炎癥反應與胃息肉的發生發展密切相關。臨床研究發現，胃息肉患者中幽門螺桿菌感染率為58%[14]。IL-1β通過上調COX-2的表達水平促進胃黏膜上皮細胞增殖，并抑制幽門螺桿菌誘導的細胞凋亡[15]。本研究發現，CIP2A過表達的GES-1細胞中IL-1β與IL-10的水平明顯升高，由此，炎癥反應也與CIP2A對GES-1細胞的促增殖作用相關。

Rb基因家族處于細胞周期調控的中心環節，在細胞生長和分化的調控中發揮重要作用[16]。E2F1作為重要的細胞周期調控因子，與Rb一起參與調控細胞由G0/G1期向S期的過渡[17]。Rb/E2F1途徑通過調節細胞周期在食管癌的發展中發揮重要的作用[18]。研究表明，E2F1與CIP2A之間的反饋調節回路為p53和Rb缺失的癌細胞提供了治療方法[19]。沉默CIP2A可抑制人乳頭瘤病毒E7蛋白誘導的細胞增殖，而過表達E2F1處理使細胞增殖活性顯著升高[20]。因此，E2F1是CIP2A發揮促進增殖作用的關鍵調節因子。本研究表明，CIP2A過表達促進Rb磷酸化和E2F1、cyclin D1的表達，而沉默E2F1則抑制了CIP2A的作用，由此推斷，Rb/E2F1通路可能參與CIP2A調節GES-1細胞增殖和凋亡的過程。

綜上所述，本研究通過將CIP2A過表達重組腺病毒轉染GES-1細胞，發現CIP2A可通過激活Rb/E2F1通路、促進IL-1β和IL-10的分泌，上調周期蛋白cyclin D1水平，促進GES-1細胞增殖并抑制凋亡。文章通過研究CIP2A過表達對GES-1細胞的影響，闡明了CIP2A誘導腺瘤性胃息肉發生的相關機制，有利于進一步研究揭示胃息肉惡變過程中的分子生物學機制。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of CIP2A over-expression on proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells

ZHANG Hai-yun, CHANG Xiang-rong

(DepartmentofGastroenterology,ShaanxiKangfuHospital,Xi’an710065,China.E-mail:fangjiezhengzhou@163.com)

AIM: To investigate the effects of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A) over-expression on the proliferation and apoptosis of gastric epithelial cells. METHODS: The mRNA expression of CIP2A and cyclin D1 in the tissues of normal gastric mucosa and gastric polyps was detected by RT-qPCR. The GES-1 cells were divided into control group, Ad-emp group and Ad-CIP2A group. The cell proliferation ability was detected by MTT assay and BrdU assay, and the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of apoptosis-related molecules was determined by Western blot and RT-qPCR. The levels of inflammatory cytokines were measured by ELISA after GES-1 cells were infected with Ad-emp and Ad-CIP2A. Furthermore, the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 in the GES-1 cells was determined by Western blot after transfected withE2F1 siRNA. RESULTS: The expression of CIP2A and cyclin D1 in adenomatous gastric polyps tissues was significantly higher than that in normal gastric mucosa tissues, and no significant change of that between hyperplastic gastric polyps tissues and normal gastric mucosa was observed. After transfected with CIP2A, the proliferation ability of GES-1 cells was increased, the cell apoptosis was inhibited, the concentrations of IL-1β and IL-10 was up-regulated and the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 were increased, while the protein levels of p-Rb, E2F1 and cyclin D1 were significantly decreased after transfected withE2F1 siRNA. CONCLUSION: CIP2A promotes the proliferation and inhibits the apoptosis of GES-1 cells by activating Rb/E2F1.

Cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A; Cell proliferation; Apoptosis

1000- 4718(2016)10- 1881- 06

2016- 05- 13

2016- 07- 15

△通訊作者 Tel: 029-86673458; E-mail： fangjiezhengzhou@163.com

R573; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.023

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