氣相色譜法測定蟬花中角鯊烯的含量

凡軍民， 賈 君，謝春芹， 韓艷麗

(江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400)

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氣相色譜法測定蟬花中角鯊烯的含量

凡軍民， 賈 君*，謝春芹， 韓艷麗

(江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212400)

[目的]建立毛細管氣相色譜(GC)測定蟬花中角鯊烯含量的方法。[方法]采用氣相色譜法測定蟬花中角鯊烯，并對不同部位天然蟬花的角鯊烯含量進行比較，確定蟬花中角鯊烯含量測定的最佳條件。[結果]1 g蟬花經超聲波提取后，經1 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液40 ℃皂化5 min，再經正已烷萃取凈化，采用GC法測定角鯊烯含量。該方法在角鯊烯質量濃度為21.43～214.30 μg/mL(r=0.999 2) 范圍內線性關系良好，方法精密度良好(RSD=3.71%)，加標回收率為77.80%～97.32%，平均加標回收率(n=9)為88.10%。[結論]氣相色譜法簡單快速，污染小，檢測靈敏度高，可用于蟬花中角鯊烯含量的測定。

蟬花；角鯊烯；氣相色譜法

蟬花(CordycepscicadaeShing)是一些蟬的土棲若蟲受到蟬擬青霉(PaecilomyescicadaeSamson)真菌寄生的產物，與名貴中藥材冬蟲夏草的無性系同屬，金蟬花可以作為冬蟲夏草的代用品，起到滋補養生的作用[1]。研究表明，蟬花含有多種活性成分，具有調節免疫功能和脂類代謝，改善機體的營養狀況，抗疲勞、解熱鎮痛和滋補強壯等作用[2]。

角鯊烯又名鯊烯、鯊萜，是所有細胞中甾醇的前體，不飽和程度較高，是一種非常重要的功能油脂[2-3]。角鯊烯具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、抗心血管疾病、抗感染、提高免疫調節等多種生理功能[4]，因此被廣泛應用于保健食品、醫藥及化妝品等行業。目前，角鯊烯含量的測定方法主要有氣相色譜法(GC)[5-6]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[7-8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-10]以及超高效液相色譜法(UPLC)[11-12]。由于角鯊烯的極性較小，易溶解于非極性溶劑中，故檢出限均高于氣相色譜和氣質聯用色譜法而很少被應用于分析檢測中。氣相色譜法測定中大多數采用有機溶劑溶解直接進樣，不僅污染了色譜柱，還縮短了色譜柱的使用壽命。由于角鯊烯是一種脂質不皂化物，因此可對樣品進行皂化前處理，然后萃取凈化皂化液，從而可脫除樣品中較多的雜質峰。筆者建立了氣相色譜法測定蟬花中角鯊烯的色譜條件，并對不同部位天然蟬花的角鯊烯含量進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。蟬花(CordycepscicadaeShing)產自江蘇省句容市磨盤山；角鯊烯對照品(含量99.5%)，中國藥品生物制品檢定所，批號140721-200601；正己烷為色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備。Agilent 7890A-FID氣相色譜儀，MD 200氮氣吹掃儀，梅特勒-托利多ME204E 電子天平，艾本森MixPuls渦旋混合儀，KH5200型超聲波清洗器，DJ-04B型粉碎機。

1.2 方法

1.2.1 對照品儲備液的制備。精密稱取角鯊烯對照品適量，置50 mL容量瓶中，加正己烷溶解稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為214.30 mg/mL的對照儲備液。

1.2.2 供試溶液的制備。精密稱定烘干至恒重的樣品粉末約1 g，置于50 mL離心管中，加正己烷20 mL，在40 kHz、200 W條件下超聲提取30 min，冷卻后過濾，將濾液用氮氣吹干。在吹干的蟬花脂肪酸中加入0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液 1.0 mL，搖勻，40 ℃水浴加熱5 min，取出冷卻，加入正己烷2.0 mL萃取，靜置 10 min，取上清液，過 0.22 μm濾膜，作為供試溶液，備用。

1.2.3 氣相色譜條件。采用Agilent HP-5毛細管色譜柱(30.00 m × 0.32 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies)，載氣為氮氣(純度 99.999%)；空氣流速400 mL/min，氫氣流速30 mL/min，氮氣流速2 mL/min；檢測器FID溫度為290 ℃，進樣口溫度為280 ℃，進樣量為1 μL，分流比為10∶1；程序升溫：初始溫度180 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化 采用超聲、索氏2種方法進行提取，蟬花中角鯊烯質量百分含量相當，索氏提取法較繁瑣、加熱回流時間較長，因此選擇超聲提取。參照 GB/T 22110—2008，采用正己烷作為提取溶劑，對蟬花(1 g)提取油進行甲酯化條件的選優，結果表明，皂化溫度40 ℃，皂化時間5 min，氫氧化鈉-甲醇濃度0.5 mol/L，加入量1.0 mL為最佳皂化反應條件。

2.2 色譜條件的選擇 由于角鯊烯易溶于非極性溶劑，一般采用非極性色譜柱用于角鯊烯的分離和測定，因此該試驗采用非極性色譜柱 HP-5耐高溫低流失毛細管柱。角鯊烯沸點高、難揮發，出峰時間較晚，因此采用180 ℃柱溫作為初始溫度，并在較文獻[9]低的溫度250 ℃下保持10 min，結果減少了角鯊烯檢測時間，色譜峰的分離效果好且基線較平穩。在此色譜條件下，角鯊烯標準品與樣品的色譜圖見圖1。

圖1 角鯊烯對照品(A)、蟬花(B)的GC色譜Fig.1 Gas chromatography of squalene reference substances (A) and C.cicadae (B)

2.3 方法學評價

2.3.1 線性關系考察。分別精密移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL對照儲備液，用正己烷定容于2 mL容量瓶中，搖勻，得各濃度對照品溶液，按“2.2”色譜條件測定。以角鯊烯質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算得到回歸方程Y=2.038 9X+4.123 2 (r=0.999 2，n=6)，結果表明角鯊烯質量濃度在21.43～214.30 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗。取同一對照品溶液按“1.2.3”色譜條件測定，連續進樣 6 次，計算峰面積相對標準偏差，RSD為1.15% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗。取蟬花粉6份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，按“1.2.3”色譜條件測定，根據標準曲線計算角鯊烯的含量，得角鯊烯的平均質量分數為28.00 μg/g，RSD為3.71% (n=6)，結果表明制備方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗。取同一供試溶液按“1.2.3”色譜條件測定，每隔2 h進樣1次，共進樣7次，計算峰面積相對標準偏差，RSD為3.23%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.5 回收率試驗。精密稱取同一批蟬花粉樣品約1 g，共9 份，分別精確加入42.86 μg/mL角鯊烯對照品溶液1.00、1.50、2.00 mL 各 3 份，按“1.2.2”方法制備供試溶液，得出角鯊烯的平均回收率為88.10%(n=9)，結果見表 1。

表1 加標回收率試驗結果(n=9)

2.4 樣品中角鯊烯含量測定 采用“1.2.2”方法制備供試溶液，按“1.2.3”色譜條件測定，根據標準曲線計算角鯊烯的含量，測定結果得出，天然蟬花和蟬花蟲體中角鯊烯含量分別為(26.67±0.57)、(49.61±0.38)μg/g,蟬花子座中未檢出角鯊烯。由此可以看出，蟬花子座中角鯊烯含量極其微少或不存在。天然蟬花復合體由子座和蟲體2部分構成，蟬花蟲體中的角鯊烯含量大于子座，說明角鯊烯在天然蟬花中分布是不均勻的。

3 結論與討論

該試驗采用的方法測定天然蟬花中角鯊烯含量為(27.76±0.57) μg/g，與衛亞麗等[5]測定結果(74.36±0.24)μg/g的差異較大。蟬花角鯊烯含量差異的原因，可能一方面與蟬花的產地有關，另一方面與角鯊烯的提取方法有關。具體的提取方法還有待進一步研究。

該研究建立了毛細管氣相色譜測定蟬花的角鯊烯含量的方法，升溫程序簡單，樣品分析時間短，重復性好，靈敏度高，角鯊烯色譜峰分離效果好，經過不同樣品測定，定量準確，故此方法可以用于蟬花中角鯊烯含量的測定。

[1] 王瓊，王春雷，何福根,等.地方藥材金蟬花的研究進展[J].腫瘤學雜志,2013,19(3):227-230.

[2] 官波,鄭文誠.功能性脂質——角鯊烯提取純化及其應用[J].糧油食品科技,2010,18(4):27-30.

[3] NAZIRI E,TSIMIDOU M Z.Formulated squalene for food related applications[J].Recent Pat Food Nutr Agric,2013,5(2):83-104.

[4] 王寶琴，任麗麗.角鯊烯的來源及其制備方法研究進展[J].食品研究與開發,2015,36(21):193-197.

[5] 衛亞麗,楊茂發,劉愛英,等.毛細管氣相色譜法測定中藥蟬花中角鯊烯的含量[J].藥物分析雜志,2014,34(11):1975-1978.

[6] 王李平,林晨,蔡大川,等.氣相色譜法測定茶油中角鯊烯的含量[J].食品工業,2015,36(2):284-286.

[7] 汪運明,陳華勇,楊繼國,等.氣相色譜質譜聯用測定茶油中角鯊烯含量[J].食品工業科技,2011,32(6):404-406.

[8] 石金娥,于海玲,王巖,等.氣相色譜-質譜聯用測定南瓜籽油中角鯊烯的含量[J].中國油脂,2014,39(11):88-91.

[9] 陳偉珠,晉文慧,張怡評,等.角鯊烯的高效液相色譜檢測法[J].食品研究與開發,2015,36(24):131-134.

[10] 張欣,于瑞祥,楊瑞鈺,等.植物油中角鯊烯的提取與高效液相色譜法分析[J].中國糧油學報,2013,28(5):96-99.

[11] 陳偉珠,方華,張怡評,等.超高效液相色譜法檢測角鯊烯[J].食品與發酵科技,2014,50(6):74-77.

[12] 榮維廣,劉華良,李莉,等.超高效液相色譜法測定保健食品中角鯊烯[J].預防醫學情報雜志,2013,29(8):734-736.

Determination of Squalene in Cordyceps cicadae Shing by Gas Chromatography

FAN Jun-min,JIA Jun*,XIE Chun-qin et al

(Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry,Jurong,Jiangsu 212400)

[Objective] To establish a method of capillary gas chromatography to detect the content of squalene inCordycepscicadae.[Method] Squalene inCordycepscicadaeShing was detected by gas chromatography.And the squalene contents in different parts ofC.cicadaewere compared.The optimal condition for the detection of squalene inC.cicadaewas obtained.[Result]C.cicadae(1 g) was extracted by ultrasonic extraction,the product was methyl esterified at 40 ℃ for 5 min by 1 mL of 0.5 mol/L sodium hydroxide-methanol solution and then extracted by n-hexane.The squalene could be determined quantitatively by GC.When the squalene concentration was from 21.43 to 214.30 μg/mL,there was a good linear relation (r=0.999 2) and a perfect method precision (RSD= 3.71%),and the recovery rate was 77.80%-97.32%,and the average recovery rate was 88.10% (n=9).[Conclusion] This method was simple and rapid with low pollution and high sensitivity,and it is suitable for determination of squalene content inC.cicadae.

CordycepscicadaeShing; Squalene; Gas chromatography

江蘇農林職業技術學院科研基金項目(2015kj034)；創新團隊科研基金項目(2014td002)。

凡軍民(1977- )，女，湖北荊州人，副教授，博士，從事食品及相關產品的檢測研究。*通訊作者，教授，博士，從事食品檢測研究。

2016-07-29

TS 201.2

A

0517-6611(2016)28-0094-02