丁勁 張耀圣 商建偉 李曰慶 柴立民 李憲瑞 盛文 韋翊 馬健雄

益腎健脾方對少弱精子癥小鼠模型睪丸生精功能和血清性激素水平的影響

丁勁 張耀圣 商建偉 李曰慶 柴立民 李憲瑞 盛文 韋翊 馬健雄

目的 觀察益腎健脾方對雷公藤多苷誘導少弱精子癥小鼠模型睪丸組織、精液質量和血清性激素水平的影響,探討益腎健脾方治療少弱精子癥可能的作用機制。方法 以雷公藤多苷誘導少弱精子癥小鼠模型,隨機平均分為正常組、模型組、左卡尼汀組、中藥組(益腎健脾方低、高劑量組),每組10只,中藥及左卡尼汀干預,睪丸組織病理切片、HE染色,觀察小鼠睪丸組織病理學,應用偉力精子測試儀檢測小鼠精液質量,應用酶聯免疫夾心法檢測小鼠血清性激素水平。結果

益腎健脾方; 少弱精子癥; 雷公藤多苷; 精液質量; 血清性激素

據WHO最新統計[1],不孕不育問題中男性因素占到40%～50%,其中高達60%～75%為特發性,少弱精子癥是引起男性不育癥的常見原因。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,GTW)為制備少弱精子癥動物模型常用的造模藥物[2],本研究采用GTW制備少弱精子癥小鼠模型,觀察益腎健脾方對少弱精子癥小鼠模型睪丸組織、精液質量和血清性激素水平的影響,探討益腎健脾方治療少弱精子癥可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

BALB/c小鼠,雄性,SPF級,體質量18～20 g,共60只。由北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥品和試劑

雷公藤多苷片,10 mg/片,安徽新隴海藥業有限公司生產,生產批號:國藥準字Z34021048。左卡尼汀組給予東維力口服液(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司生產,10 mL/瓶,國藥準字:H19990372,生產批號:0904031)。益腎健脾方:菟絲子30 g、枸杞子30 g、五味子10 g、黨參20 g、生黃芪10 g、陳皮10 g、柴胡6 g、升麻6 g、紅花6 g、川芎6 g,北京中醫藥大學東直門醫院提供,由北京康仁堂有限公司生產統一編號的免煎顆粒。FSH試劑盒(德國DRG: 1288),LH試劑盒(德國DRG:1289),T試劑盒(德國IBL RE52041)。

1.3 儀器

Olympus BX60光學顯微鏡,Olympus公司生產; LKB-NOVA型超薄切片機,瑞士DAKO公司生產;偉力精子測試儀WLJU-9000。Multiskan MK3酶標儀,Thermo Fisher Scientific公司生產。

1.4 實驗動物分組、造模及藥物干預

取雄性BALB/c小鼠60只,將其隨機分為正常組、模型組、左卡尼汀組、中藥組(益腎健脾方低、高劑量組),每組12只;除正常組外各組小鼠給予連續每天灌胃GTW4周(40 mg/kg),制備少弱精子癥模型;造模結束后,左卡尼汀組、中藥組每天分別給予灌胃東維力口服液(10 mL/kg)、益腎健脾方低、高劑量(分別為1.35 mg/kg、2.70 mg/kg)共4周,正常組、模型組給予連續每天灌胃等量蒸餾水(10 mL/kg);末次給藥后30分鐘,處理小鼠,摘取睪丸、附睪組織后進行相關指標檢測。在實驗過程中,造模4周后,于正常組和模型組中分別隨機選取2只小鼠檢測造模;因小鼠相互打斗,正常組死亡兩只小鼠,中藥低劑量組死亡一只小鼠,剩余53只小鼠。

1.5 血清性激素水平檢測

于末次給藥后30分鐘頸椎脫臼法處死小鼠,眼球采血,3000 rpm離心15分鐘,收集小鼠血清,按照試劑盒說明書操作采用酶聯免疫夾心法檢測小鼠血清中卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、睪酮(testosterone,T)水平。

1.6 睪丸組織病理、HE染色

剝離小鼠睪丸,每組隨機選取睪丸3個,經4%多聚甲醛固定過夜,常規石蠟包埋,切取3 μm石蠟組織切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木素染色,流動水沖洗后,伊紅染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下分析睪丸組

織病理,并拍照分析。

1.7 附睪精液質量檢測

將摘取的左側附睪放入盛有1.0 mL培養液的EP管中(提前已預熱至37℃),剪碎附睪,充分搖勻,使精子充分游離,于37℃孵育15分鐘。小心吸取上層液體,1 500 rpm離心5分鐘,沉淀物加入1 mL BWW高蛋白獲能液,置于3℃恒溫孵育箱中獲能2小時,采用CASA技術應用偉力彩色精子質量檢測系統測定精子活力、總數等指標。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 益腎健脾方對少弱精子癥小鼠睪丸組織病理學的影響

正常組小鼠睪丸曲細精管排列規則、整齊、緊密,其內可見各級生精細胞,包括大量精子及精子細胞。模型組小鼠睪丸曲細精管萎縮,排列不規則,官腔間隙較大,其內各級生精細胞排列紊亂、疏松,數量明顯減少。藥物干預后少數曲細精管內生精細胞減少,病變程度及范圍較模型組顯著減輕,中藥高劑量組接近正常組。見圖1。

圖1 各組小鼠睪丸組織病理切片(HE×400)

2.2 GTW對少弱精子癥小鼠模型精液質量的影響及益腎健脾方的干預作用

實驗結果組間比較經卡方檢驗分析統計提示,模型組A級精子活力、總活力低于正常組(P＜0.001);藥物干預4周后顯示左卡尼汀組、中藥低、高劑量組高于模型組(P＜0.05);左卡尼汀組與中藥高劑量組相比差異無統計學意義(P＞0.05);左卡尼汀組、中藥高劑量組低于中藥低劑量組(P＜0.05)。實驗結果組間比較經配對t檢驗分析統計提示,模型組精子數量低于正常組(P＜0.05);藥物干預4周后顯示左卡尼汀組、中藥低、高劑量組高于模型組(P＜0.05)。左卡尼汀組、中藥低、高劑量組之間相比無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 GTW對少弱精子癥小鼠模型精液質量的影響及益腎健脾方的干預作用(±s,n=8)

表1 GTW對少弱精子癥小鼠模型精液質量的影響及益腎健脾方的干預作用(±s,n=8)

注:與正常組比較aP＜0.001;與藥物干預組比較bP＜0.05;與中藥高劑量組比較cP＞0.05;與中藥低劑量組比較dP＜0.05;與中藥高劑量組比較eP＜0.05;與正常組比較fP＜0.05;與藥物干預組比較gP＜0.05。

20.94±6.2758.75±16.4210.28±4.19模型組等量蒸餾水3.31±3.25ab8.89±8.08ab2.27±0.89左卡尼汀組10 mL/kg8.83±5.54cd23.76±15.91cd4.79±1.48fg中藥低劑量組1.35 mg/kg20.03±7.0e53.93±20.80e6.51±0.93中藥高劑量組組別劑量A級(%)總活力(%)總數(×106) 2.70 mg/kg10.88±1.9628.92±9.125.28±2.36正常組等量蒸餾水

2.3 益腎健脾方對少弱精子癥小鼠模型血清性激素水平的調節作用

實驗結果組間比較經配對t檢驗分析統計提示,模型組血清FSH、LH水平高于正常組(P＜0.05);藥物干預4周后左卡尼汀組、中藥低、高劑量組與正常組相比無統計學意義(P＞0.05);左卡尼汀組、中藥低、高劑量組低于模型組(P＜0.05);左卡尼汀組、中藥低、高劑量組之間相比無統計學意義(P＞0.05)。模型組血清T水平低于正常組(P＜0.01)。藥物干預后左卡尼汀組、中藥低、高劑量組與模型組相比無統計學意義(P＞0.05);左卡尼汀組、中藥低、高劑量組之間相比無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 益腎健脾方對少弱精子癥小鼠模型血清性激素水平的調節作用(

3 討論

目前少弱精子癥模型造模方法有GTW、甲硝唑、腺嘌呤、環磷酰胺等制備的懸液灌胃[2],其中較為常用的為GTW。大量實驗及臨床研究表明雷公藤制劑及其多種成分具有生殖系統毒性,男性若長期服用會出現少精子癥、弱精子癥,甚至無精子癥的現象[3]。精子超顯微結構出現線粒體鞘受損、胞漿膜缺損和染色質解聚等[4]。前期實驗研究發現,采用40 mg/(kg·d)的GTW連續灌胃4周,可以得到比較理想的少弱精子癥大鼠模型[5]。本研究發現模型組精子活力、總數明顯低于正常組(P＜0.05),制備少弱精子癥模型較為理想。

男性精子的發生成熟受到下丘腦-垂體-性腺軸的調節作用[6]。FSH作用靶點主要為生精上皮中的支持細胞,精子發生與其密切相關。但當血清FSH水平異常升高時,生精上皮同樣會受到損傷; LH作用靶點主要為間質細胞,與間質細胞膜受體結合可促使其持續產生T,高濃度的雄激素環境是精子發生所必需的[7]。相關研究表明血清性激素水平與精液質量之間存在著一定關聯[8-10],FSH水平較低時發生弱精子癥的比例也較低,LH水平較高時精子活力低下的比例較高。實驗結果顯示:模型組小鼠血清FSH、LH水平較正常組顯著升高(P＜0.05),說明生精上皮受到損害。血清T較正常組顯著下降相一致(P＜0.05);藥物干預后小鼠血清FSH、LH低于正常組平均水平,這也說明GTW對小鼠睪丸生精功能產出不可逆的損傷。左卡尼汀口服液其主要成分為左旋肉毒堿[11-14],左旋肉毒堿能夠促進β氧化過程,參與精子的能量代謝、降低精漿中的活性氧物質、抗精子凋亡等、穩定精子細胞膜等。與精子的發生、運動及成熟關系密切。相比較選擇經典方劑或者中成藥作為對照組的其他研究,本研究選擇有效治療少弱精子癥的西藥左卡尼汀口服液使得實驗設計更為合理。

中醫學認為精是構成人體的基本物質,先天之精稟受于父母,后天之精來源于水谷精微,由脾胃化生。先后天之精相互依存、相互促進。腎藏精,主生殖,為先天之本。腎氣不足則腎不藏精,少精、弱精而致男子不育;脾主運化水谷精微,轉輸津液,為后天之本。脾失健運,化生乏源,腎精無以充養,少精、弱精而致男子不育。由此,筆者認為“脾腎虧虛,精失所養”是少弱精癥形成的基本病機,病位在腎、在脾,治療上應以“益腎健脾填精”為主,相比較單純應用補腎填精法治療更具有優勢[15],前期臨床運用益腎健脾法治療精索靜脈曲張所致少弱精子癥取療效顯著。綜合以上討論和分析發現,益腎健脾方對GTW的生殖系統毒性具有一定的拮抗作用,可能通過調節小鼠血清性激素水平來提高睪丸精子發生、成熟,改善精液質量達到治療少弱精子癥的目的。

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Influences of Yishen Jianpi recipe on spermatogenesis function and serum sex hormone level of the mice model of oligoasthenotspermia

DING Jin,ZHANG Yao-sheng,SHANG Jian-wei,et al.Male Department of Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China

SHANG Jian-wei,E-mail:sjw313@163.com

Objective To observe the changes of the testis tissue,semen quality and serum sex hormone level in mice model of oligoasthenotspermia induced by tripterygium glycosides,and discuss the possible intervention mechanism of Yishen Jianpi recipe to oligoasthenotspermia.Methods Mice model of oligoasthenotspermia was induced by tripterygium glycosides and the mice were randomly divided into normal group,model group,L-carnitine group,Chinese medicine group(Yishen Jianpi recipe low-dose and high-dose group)each group inclucled 120 mice.Chinese medicine and L-carnitine were used for intervention,Pathological section HE staining and electron microscope were used to observe the pathological changes of tissue,Weili sperm tester were used to observe the semen quality,serum sex hormone levels were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results A level and total sperm motility in the

Yishen Jianpi recipe; Oligoasthenotspermia; Tripterygium glycosides; Semen quality; Serum sex hormone level

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.11.007

2016-03-07)

(本文編輯:禹佳)

國家自然科學基金(81273756);北京中醫藥大學中青年教師資助項目(2015-JYB-JBMS062)

100700 北京中醫藥大學東直門醫院男科[丁勁(碩士研究生)、張耀圣、商建偉、李曰慶、李憲銳(碩士研究生)、盛文(碩士研究生)、馬健雄(碩士研究生)],中醫內科教育部和北京市重點實驗室[柴立民、韋翊(碩士研究生)]

丁勁(1988-),2013級在讀碩士研究生。研究方向:中西醫結合防治男性疾病。E-mail: djdoctor203@163.com

商建偉(1983-),2015級在讀博士研究生,主治醫師。研究方向:中西醫結合治療男性疾病。E-mail:sjw313@163.com

左卡尼汀組、中藥組的A級精子活力、總活力高于模型組(P＜0.05);左卡尼汀組低于中藥低劑量組(P＜0.05);中藥高劑量組與左卡尼汀組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。左卡尼汀組、中藥組的精子總數高于模型組(P＜0.05);左卡尼汀組、中藥低、高劑量組之間相比差異無統計學意義(P＞0.05)。模型組小鼠血清卵泡刺激素、黃體生成素水平高于正常組及各藥物干預組(P＜0.05);各藥物干預組高于模型組(P＜0.05);各藥物干預組之間相比差異無統計學意義(P＞0.05);模型組及各干預組血清睪酮低于正常組(P＜0.05);模型組與各干預組之間相比差異無統計學意義(P＞0.05)。結論 益腎健脾方可能通過調節小鼠血清性激素水平從而改善精液質量達到治療少弱精子癥的目的。

L-carnitine group and Chinese medicine group were higher than those in the model group(P＜0.05);the L-carnitine group were lower than the low-dose group(P＜0.05);compared with the L-carnitine group,the high-dose group was not significant difference(P＞0.05).Sperm total in the L-carnitine group and Chinese medicine group were higher than that in the model group(P＜0.05);among the L-carnitin group,low-dose and high-dose group,there were no statistical significance(P＞0.05).Serum follicle stimulating hormone and lutein level in other group were higher than that in the normal group(P＜0.05);intervention groups were higher than model group(P＜0.05);there was no significance difference between model group and intervention groups(P＞0.05).There was no significance difference in serum T level between the model group and intervention groups(P＞0.05);the model group and intervention group were lower than that in the normal group(P＜0.05).Conclusion Yishen Jianpi recipe can regulate the level of serum sex hormone in mice model of oligoasthenotspermia and affect the occurrence of sperm to achieve the goal of improving the quality of semen in the treatment of oligoasthenotspermia.