血清miR-221表達水平對老年哮喘的診斷價值

吳 瓊，劉錦銘

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血清miR-221表達水平對老年哮喘的診斷價值

吳 瓊，劉錦銘

目的 檢測老年哮喘患者的血清miR-221表達水平，并評價血清miR-221對老年哮喘的診斷價值。方法 選取我院109位老年哮喘患者(實驗組)和115位健康老年人(對照組)。采用RT-PCR檢測2組老年人血清miR-221表達水平，并對結果進行ROC曲線繪制。Elisa法測定2組老年人血清白細胞介素(IL)-4和IL-12濃度，同時對2組老年人進行肺功能檢測。最后應用Spearman相關分析計算血清miR-221表達水平與血清細胞因子濃度和肺功能參數的相關性。結果 與對照組比較，實驗組患者血清miR-221表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。ROC曲線繪制結果顯示，血清miR-221的診斷閾值為1.37。實驗組和對照組患者的血清IL-4濃度、血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值差異均存在統計學意義(P<0.05)。用Spearman相關分析發現，血清miR-221表達水平與血清IL-4濃度、血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值均存在顯著相關性(P<0.05)。結論 血清miR-221的表達水平可以作為老年哮喘病情判斷指標，同時也為老年哮喘的臨床治療開辟了新思路。

老年哮喘；miR-221；白細胞介素-4；白細胞介素-12；肺功能；診斷

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一類老年人群體常見的慢性呼吸系統疾病，可以導致患者出現氣道炎癥、氣道高反應、黏液分泌增多和氣道阻塞等癥狀[1-2]。近年來哮喘的發病率和死亡率均呈現逐年增加的趨勢[3]，因此，及時對哮喘做出正確診斷對改善老年患者的預后十分重要。雖然哮喘發病的根本原因目前尚不完全明晰，但大量的研究[4]均已表明，microRNA(miR)在哮喘發病中起到了十分重要的作用。近年來，研究發現miR-21、miR-145、miR-221等均與哮喘的發病進程密切相關[5]。miR-221不僅在老年哮喘患者血清中呈現顯著高表達，同時哮喘小鼠模型也驗證了miR-221能夠促進白細胞介素(IL)-4的分泌[6]。因此，筆者推測血清miR-221是一種合適的老年哮喘診斷標志物。相較于其他老年哮喘診斷方法，血清診斷具有簡便快捷、費用低廉的優勢。本研究著重檢測老年哮喘患者血清miR-221的表達水平，并通過繪制ROC曲線獲得診斷閾值，最后應用Spearman相關分析計算血清miR-221的表達水平及其與血清細胞因子濃度和肺功能參數的相關性，從而綜合評價血清miR-221的表達水平對老年哮喘的診斷應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 實驗組共選取2013年8月至2015年12月在我院就診的老年哮喘患者109例，其中男性50例，女性59例，所有患者均符合中華醫學會全國哮喘學術會議制定的診斷標準。患者年齡60～77歲，平均(68.9±5.0)歲。對照組隨機選取在本院呼吸科門診體檢的115例無家族疾病史的健康老年人，其中男性54例，女性61例，年齡60～78歲，平均(69.2±4.9)歲。2組患者在年齡、性別、民族和居住地等比較差異均無統計學意義(P<0.05)。本研究已獲得醫院倫理委員會的批準，2組老年本人或其子女簽署書面知情同意書。

1.2 血清采集 2組老年人分別于清晨空腹采集2 ml外周靜脈血于干燥試管內，室溫100×g離心10 min后收集上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 血清miR-221表達水平檢測 2組老年人均取1 ml血清，應用TRIZOL試劑盒(購自美國Invitrogen公司)提取血清總RNA。應用TaqMan?MicroRNA逆轉錄試劑盒(購自美國Fermentas公司)將提取的RNA反轉錄成cDNA。應用TaqMan?Gene Expression Assay試劑盒(購自美國Fermentas公司)對miR-221和內參U6進行實時定量PCR(RT-PCR) 擴增。設定擴增反應條件為：95 ℃預變性15 min后，94 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環。miR-221的相對表達水平采用2-△△Ct法進行分析，即ΔΔCt=實驗組ΔCt-對照組ΔCt，而ΔCt=miR-221Ct-U6 Ct。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

基因名引物序列miR-221正向5'-AGCUACAUUGU-CUGCUGGGUUUC-3'反向5'-GAAACCCAGCAGACAAUGUAGCU-3'U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.4 血清細胞因子濃度檢測 2組老年人均取1 ml血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法定量檢測血清IL- 4、IL-12濃度，ELISA試劑盒均購自深圳晶美生物制品公司，嚴格按照產品說明書進行操作。

1.5 肺功能檢測 采用日本美能AS-500便攜式肺功能儀，由肺功能室專人負責對2組老年人進行肺功能檢測。檢測時要求受試者站直或坐直，保持頭部自然水平，夾上鼻夾，口唇包上緊口器，松解過緊的腰帶及衣物領口等，檢測過程中依據檢測情況決定檢測次數，并選擇最合適的數值進行記錄。檢測的主要參數包括用力通氣量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，FEV1)和最大呼吸峰流速(peak expiratory flow，PEF)值，需要注意的是肺活量受年齡、性別、身高、體表面積等的影響，正常人群為(100±20)%，<80%為減少。所有參數均以實測值占預計值的百分比表示，以預計值百分率作為指標來判斷。

1.6 統計學處理 本實驗應用SPSS 19.0和GraphPad統計軟件進行數據統計分析。計量資料均以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。根據檢測結果繪制ROC曲線，根據ROC曲線下面積和診斷閾值確定相對應的敏感性和特異性。采用Spearman相關分析計算血清miR-221表達水平與血清細胞因子濃度和肺功能檢查參數的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清miR-221表達水平檢測RT-PCR檢測2組老年人血清miR-221表達水平，結果如圖1所示。實驗組血清miR-221表達水平為2.04±0.32，而對照組血清miR-221表達水平為1.00±0.19，2組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

注：與對照組比較aP<0.05圖1 對照組和實驗組老年人血清miR-221表達水平比較

2.2 繪制ROC曲線 根據血清miR-221檢測結果繪制ROC曲線，其曲線下面積為0.933，診斷閾值為1.37，敏感性為94.0%，特異性為85.2%。說明血清miR-221可以用作一種潛在的檢測標志物用于診斷老年哮喘。見圖2。

圖2 血清miR-221表達水平的ROC曲線

2.3 血清IL-4、IL-12水平檢測 實驗組血清IL-4濃度為(124.89±35.25)ng/L，而對照組血清IL-4濃度為(51.32±19.03)ng/L，老年哮喘患者血清IL-4濃度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。實驗組血清IL-12濃度為(36.06±10.13)ng/L，而對照組血清IL-12濃度為(62.33±12.37)ng/L，老年哮喘患者血清IL-12濃度明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

注：與對照組比較aP<0.05。A為血清IL- 4濃度比較，B為血清IL-12濃度比較圖3 對照組和實驗組老年人血清細胞因子IL- 4、IL-12濃度比較

2.4 肺功能檢測 實驗組FVC為(72.39±25.76)%，而對照組FVC為 (102.83±17.93)%。相較于健康老年人，老年哮喘患者FVC出現明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。實驗組FEV1為(69.23±21.73)%，而對照組FEV1為(104.38±13.72)%。相較于對照組，老年哮喘患者FEV1出現明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。PEF為(69.31±22.18)%，而對照組PEF為(107.97±24.21)%，實驗組患者PEF明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 對照組和實驗組老年人肺功能參數比較(%，x±s)

注：FVC為用力通氣量，FEV1為第1秒用力呼氣量，PEF為最大呼吸峰流速；與對照組比較aP<0.01

2.5 Spearman相關分析 采用Spearman相關分析，血清miR-221表達水平與血清IL-4濃度呈顯著正相關(P<0.05)，而與血清IL-12濃度、FVC值、FEV1值和PEF值均呈顯著負相關(P<0.05)，提示老年哮喘患者血清miR-221的異常表達與其血清細胞因子的異常濃度和肺功能的受損情況存在相關性。見表3。

表3 血清miR-221表達水平與血清細胞因子和肺功能檢測結果的相關性分析

注：FVC為用力通氣量，FEV1為第1秒用力呼氣量，PEF為最大呼吸峰流速，IL- 4為白細胞介素- 4，IL-12為白細胞介素-12

3 討論

老年哮喘患者的癥狀表現及體征差異較大，臨床診斷時比較容易出現誤診和漏診。在臨床實踐中，除肺功能檢查、痰液嗜酸粒細胞或中性粒細胞計數以外，血清中某些生物標記物的異常變化亦可作為診斷老年哮喘的參考依據。與蛋白質和mRNA相比，miRNA長度較短，因此患者的血清miRNA表達水平更容易被一些常規實驗技術如RT-PCR檢測到。

作為一種非編碼小分子RNA，miRNA能夠由不同細胞表達并分泌進入外周血循環，其在血清中的異常表達常與癌癥、神經系統疾病、心血管系統疾病等多種人類疾病密切相關[7]。近年來大量研究發現，miR-221在乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]等疾病中均出現異常表達，被認為可以作為這些癌癥的早期診斷標記物。肥大細胞的數量在哮喘患者的氣道中明顯增加[11]，而miR-221與氣道肥大細胞的增殖密切相關[6]。本研究對血清miR-221在老年哮喘患者和健康老年人中的表達水平進行了檢測比較，結果顯示老年哮喘患者的血清miR-221出現異常高表達，這與以前在兒童哮喘中的研究結果相一致[12]。ROC曲線繪制結果提示血清miR-221因其高敏感性和特異性，可以用作老年哮喘的診斷標志物之一。有研究[2]表明，Th1和Th2細胞亞群的免疫反應失衡是哮喘發病的核心因素，Th1細胞數量出現顯著下降，而Th2細胞數量出現顯著上升。Thl主要分泌IL-12等Thl型細胞因子，參與細胞免疫；Th2主要分泌IL-4等Th2型細胞因子，參與體液免疫。本研究發現老年哮喘患者的血清IL-4濃度顯著高于健康老年人，而血清IL-12濃度顯著低于健康老年人，這與以前在兒童哮喘研究中的結論相一致[13]。而肺功能檢測結果顯示，相較于健康老年人，老年哮喘患者的肺功能出現了顯著性損傷。此外，Spearman相關分析結果也提示血清miR-221表達水平的變化能在一定程度上反應老年哮喘患者體內免疫反應的異常和肺功能受損情況，miR-221的異常表達可能也與Th1和Th2細胞亞群的失衡存在一定的關聯。

綜上所述，血清miR-221診斷老年哮喘快速有效，具有較高的敏感性和特異性，優勢非常明顯。本研究的結果不僅為老年哮喘的臨床診斷提供了新的方法和思路，同時也為老年哮喘的后期治療工作提供了實驗依據。但由于本研究時間較短，研究樣本量也較小，因而本研究的結果需要在將來的研究中得到進一步的驗證。

[1] Rebane A, Akdis CA. Micro-RNAs in allergy and asthma[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2014, 14(4): 424. DOI:10.1007/s11882-014-0424-x.

[2] Ren YF, Li H, Xing XH, et al. Preliminary study on pathogenesis of bronchial asthma in children[J]. Pediatr Res, 2015, 77(4): 506-510. DOI:10.1038/pr.2015.11.

[3] Olin JT, Wechsler ME. Asthma: pathogenesis and novel drugs for treatment[J]. BMJ, 2014, 349: 5517. DOI:10.1136/bmj.g5517.

[4] Perry MM, Adcock IM, Chung KF. Role of microRNAs in allergic asthma: present and future[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2015, 15(2): 156-162. DOI:10.1097/ACI.0147.

[5] Bartel DP. Micro-RNAs: target recognition and regulatory functions[J]. Cell, 2009, 136(2): 215-233. DOI:10.1016/j.cell.2009.01.002.

[6] Qin HB, Xu B, Mei JJ, et al. Inhibition of miRNA-221 suppresses the airway inflammation in asthma[J]. Inflammation, 2012, 35(4): 1595-1599. DOI:10.1007/s10753-012-9474-1.

[7] Chen X, Liang H, Zhang J, et al. Secreted microRNAs: a new form of intercellular communication[J]. Trends Cell Biol, 2012, 22(3): 125-132. DOI:10.1016/j.tcb.2011.12.001.

[8] Eissa S, Matboli M, Sharawy A, et al. Prognostic and biological significance of microRNA-221 in breast cancer[J]. Gene, 2015, 574(1): 163-167. DOI:10.1016/j.gene.2015.08.004.

[9] Yang X, Yang Y, Gan R, et al. Down-regulation of miR-221 and mir-222 restrain prostate cancer cell proliferation and migration that is partly mediated by activation of sirt1[J]. PloS One, 2014, 9: 98-103.

[10] Amin K. The role of mast cells in allergic inflammation[J]. Respir Med, 2012, 106(1): 9-14. DOI:10.1016/j.rmed.2011.09.007.

[11] Liu F, Qin HB, Xu B, et al. Profiling of miRNAs in pediatric asthma: upregulation of miRNA-221 and miRNA-485-3p[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(5): 1178-1182. DOI:10.3892/mmr.2012.1030.

[12] Ray A, Cohn L. Altering the Th1/Th2 balance as a therapeutic strategy in asthmatic diseases[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2000, 1(4): 442-448.

[13] 張艷麗，王秀芳，雷瑞瑞，等. 哮喘、毛細支氣管炎患兒外周血MDSCs、IL-10和IL-12水平及意義[J]. 西安交通大學學報(醫學版), 2013, 34(4): 503-507,550. DOI:10.3969/j.issn.1671-8259.2013.04.020.

(本文編輯：王映紅)

Value of serum miR-221 expression in the diagnosis of senile asthma

Wu Qiong, Liu Jinming

(Medical College of Tongji University, Shanghai 200331, China)

Objective To investigate the expression levels of serum miR-221 in senile patients with asthma and evaluate its potential value in the diagnosis of senile asthma.Methods One hundred and nine senile patients with asthma (the experimental group) and 115 healthy senile people (the control group) were recruited for the study. The expression levels of serum miR-221 of the 2 groups were detected by RT-PCR, and the receiver operating characteristic (ROC) curve was subsequently obtained. The concentrations of serum IL-4 and IL-12 of the 2 groups were measured by ELISA, and pulmonary function test (PFT) was performed as well. Finally, Spearman method was performed for correlation analysis between serum miR-221 expression levels and serum cytokine concentrations or PFT parameters.Results Compared with that of the healthy senile people, the expression levels of serum miR-221 in the senile patients with asthma were significantly elevated, and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them(P<0.05). The diagnostic cutoff value of serum miR-221, confirmed by the ROC curve, was 1.37. There was statistical significance in IL-4 concentrations, IL-12 concentrations, FVC, FEV1 and PEF between the senile patients with asthma and healthy senile people(P<0.05). Spearman correlation analysis indicated that there was significant correlation between serum miR-221 expression levels and serum IL-4 concentrations, serum IL-12 concentrations, FVC, FEV1 or PEF(allP<0.05).Conclusion The expression level of serum miR-221 could be used as an indicator for the seriousness of senile asthma, and at the same time, it might open up a new avenue for clinical treatment of senile asthma.

Senile asthma; miR-221; IL-4; IL-12; Pulmonary function; Diagnosis

200331 上海，同濟大學醫學院(吳瓊)；上海市肺科醫院(劉錦銘)

劉錦銘，電子信箱：13761644303@163.com

R563.9

A [DOI] 10.3969/j.issn.1009-0754.2016.05.016

2016-01-28)