異氟醚對膠質瘤C57BL/6小鼠的抑瘤作用研究

胡 骕 彭 彪 羅冬冬 趙海林 李 丹 賀穎芳

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院神經外科 廣州 510095

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異氟醚對膠質瘤C57BL/6小鼠的抑瘤作用研究

胡 骕 彭 彪 羅冬冬 趙海林 李 丹 賀穎芳

廣州醫科大學附屬腫瘤醫院神經外科 廣州 510095

目的 探討吸入性麻醉藥物異氟醚對膠質瘤C57BL/6小鼠的抑瘤作用和機制。方法 將36只C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型對照組和實驗組，每組12只。采用腦膠質瘤立體定向技術進行U251膠質瘤細胞植入造模；采用核磁共振成像檢查(MRI)與蘇木精-伊紅(HE)染色評價造模成瘤與異氟醚干預后作用；采用熒光定量法檢測腦組織勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6的表達水平；采用蛋白印跡法檢查核轉錄因子-κB p65蛋白表達水平。結果 第20天實驗組腫瘤直徑明顯小于對照組(1.2±0.5mm vs 1.7±0.3mm)，差異有統計學意義(P<0.05)。HE染色病理表現提示實驗組稍好于對照組，可能有一定抑制作用。實驗組TNF-α mRNA表達量顯著少于對照組(P<0.05)，而IL-1β與IL-6表達量亦相對少于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組NF-κB p65表達與模型組相比有明顯降低(0.323±0.011 vs 0.512±0.016)，但仍然高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 吸入性麻醉藥物異氟醚能夠抑制膠質瘤的快速生長，其作用機制主要是通過抑制NF-κB p65的表達，從而減少腦組織T輔助細胞炎癥因子，起到負調控NF-κB的活化作用。

膠質瘤；異氟醚；核轉錄因子-κB；C57BL/6小鼠

腦膠質瘤是常見的中樞神經系統惡性腫瘤之一，成人發病率為3～5/10萬，具有高發病率、高度侵襲性與高病死率的特點。其發病機制尚未闡明，放化療雖然可以局部抑制膠質瘤的生長，但耐藥性與輻射抵抗性嚴重制約臨床療效[1]。研究證明，術后腫瘤細胞對放、化療不敏感是與核轉錄因子(nuclear factor，NF)-κB的活性增高有關[2]。再者，研究也表明麻醉藥物對腫瘤細胞的轉移也有一定影響，可以誘導氧化應激的發生，并且激活炎性因子水平變化，從而影響腫瘤的增殖[3]。為此，我們基于NF-κB信號通路研究異氟醚對C57 BL/6 膠質瘤小鼠的作用，探討麻醉藥物異氟醚抑制膠質瘤的具體途徑和機制，為特異而有效的個體化膠質瘤治療方案提供一定的基礎研究依據。

1 材料與方法

1．1 材料 U251膠質瘤細胞購自中國科學院上海生物學研究所。C57BL/6 小鼠，SPF級，雄性，平均體質量20～25 g，空白組、實驗組、對照組各12只，共36只；購自廣東省醫學實驗動物中心(生產許可證：SCXX粵2013-0002)。

1．2 器材與試劑 10%胎牛血清(Gibco)DMEM培養液，實驗用電鉆1臺，江灣II型立體定位儀，廣州醫科大學附屬腫瘤醫院影像學系場強飛利浦1.5T MR機，小鼠NF-κB p65抗體與抗兔二抗購自美國CST公司。

1．3 方法

1．3．1 膠質瘤小鼠模型的建立：采用立體定向技術，取對數生長期U251細胞，經0.25 %胰蛋白酶消化，離心去上清，而后用去血清維持DMEM離心洗滌2次，計細胞數，調整細胞濃度，重懸于PBS中，置于37 ℃水浴備用。小鼠以1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 腹腔注射，麻醉生效后將小鼠固定于立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至外耳道之間的毛發，常規消毒鋪單后于中線處眼裂后作一長約1.0 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1.0 mm ，右側距中線1.0 mm處鉆孔，其直徑約為1.0 mm；接種U251細胞，從恒溫水浴中取出配好的細胞懸液，以10 μL微量注射器吸取4 μL(含G L261 細胞約1×105個)，調整移動架位置，使針尖位于骨孔處，緩慢垂直進針2 mm，抽吸略后退后注入細胞懸液，注射時間持續10 min，緩慢拔針，約3 min。以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合關顱，固定于電極移動架上。觀察各組實驗動物生活狀態及生存周期；MRI 檢查實驗10 d、20 d腫瘤的生長情況；MRI成像予釓噴替酸葡甲胺0.2 mmol/kg注射后，T1加權掃描。

1．3．2 小鼠模型吸入性麻醉藥物的處理：建模后10 d與20 d，實驗組予1.4%異氟醚吸入，同時在100%氧氣的環境下作用2 h；模型對照組只接受2 h100%氧氣的作用；2組氣體通過小鼠麻醉室的流速相同。小鼠麻醉室的溫度控制在(37±0.5)℃；2 h后，將小鼠轉移到通有100%氧氣的飼養室中，直到小鼠恢復翻正反射。

1．3．3 細胞和組織的準備：第20天頸椎脫臼法處死，常規方法取小鼠腦組織。將細胞或組織在細胞或組織裂解液中進行勻漿和裂解。將得到的裂解液或勻漿液收集入EP管中，13 000 r/min離心15 min備用。常規HE染色，以10 %甲醛固定24 h ，石蠟包埋；組織切片機切成5 μm切片，HE染色，光鏡下檢查。

1．3．4實驗室檢查：熒光定量PCR法檢測三組腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。其中，TNF-α引物序列：上游5’-TACTGAACTTCGGGGTGA-’3，下游5’-ACTTGGTGGTTTGCTACG-’3；IL-1β引物序列：上游5’-GGCAGTATCACTCATTGTG-’3，下游5’-CTCCACTTTGCTCTTGAC-’3；IL-6引物序列：上游5’-GCCTTCTTGGGACTGATC-’3，下游5’-AGGTCTGTTGGGAGTGGTA-’3；內參β-actin引物序列：上游5’-CTACAATGAGCTGCGTGTG-’3，下游5’-GCGTGAGGGAGAGCATAG-’3)。PCR反應產物的相對定量分析，測得的目的基因的表達水平，均有該樣本內參β-actin基因校正，以2-△△Ct方法計算相對表達水平。

Western blot蛋白印跡法定量檢測NF-κB p65蛋白水平，掃描儀掃描膠片，采用Quantity One 4.61軟件進行條帶的灰度分析，計算p65/β-actin比值，表示p65蛋白的相對表達量。

2 結果

2．1 小鼠生存基本情況 C57BL/6小鼠接種后第5～7天自行覓食、飲水較常減少，體質量及警覺性均明顯下降；第15～20天出現行動遲緩、運動時身體向一側偏斜，雙眼稍見突起，注射側頭頂部隆起等表現。第20天吸入麻醉藥物后，未見死亡，但行動、警覺性較前明顯減弱，實驗組與對照組均能恢復翻正反射。

2．2 MRI影像學表現 2組C57BL/6 小鼠接種后10 d MRI 檢查顯示腫瘤均已形成，實驗組主要表觀為腫瘤直徑(0.5±0.3)mm，長T1長T2信號，不均勻強化，邊不清；對照組腫瘤直徑(0.6±0.2)mm，長T1長T2信號，不均勻強化，邊不清。20 d MRI 檢查顯示實驗組腫瘤直徑(1.2±0.5)mm，長T1長T2信號，不均勻強化，邊不清；對照組(1.7±0.3)mm，且長T1長T2信號，不均勻強化，中線結構移位。20 d實驗組腫瘤直徑明顯小于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2．3 病理表現 HE染色光鏡下觀察實驗組腫瘤細胞呈圓形或梭形，腫瘤細胞排列紊亂，可見生長活躍的膠質瘤細胞密集成群，并趨向正常腦組織浸潤生長。對照組腫瘤細胞細胞核呈多角或條形，核分裂相多見，細胞質較少，中心部位由于腫瘤生長過快可見壞死表現；腦組織與腫瘤交界處可見到腫瘤細胞侵入腦實質，邊界不清。HE染色病理表現，實驗組稍好于對照組，可能有一定抑制作用(見圖1)。

對照組 實驗組圖1 C57BL/6小鼠膠質瘤組織HE染色(400×)

2．4 腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達量 經熒光定量PCR檢測，實驗組TNF-α mRNA表達量顯著少于對照組(t=11.90，P=0.00)；而IL-1β與IL-6表達量亦相對少于對照組，差異存在統計學意義(P<0.05)。見表1 。

表1 腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達量

2．5 腦組織NF-κB p65的表達水平 實驗組NF-κB p65表達與模型組相比有明顯降低，但仍然高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 腦組織 NF-κB p65的表達水平

3 討論

惡性腫瘤的主要特征為細胞的無限增殖，而且具有很強的轉移性，侵襲到其他組織，治療不利使生存時間顯著縮短[4]。麻醉藥物在腫瘤的放化療及外科手術中均有應用，特別是在惡性腫瘤的切除手術中應用更為廣泛[5]，但是麻醉藥物對腫瘤的作用及其機制尚未闡明，因此麻醉藥物與腫瘤發展關系的研究將成為未來腫瘤研究的一個熱點領域[6]。

現代研究表明，NF-κB信號通路具有雙向效應，需要精確調控；過度激活的NF-κB會導致大量炎性因子表達，對機體帶來免疫損傷，減低機體對放化療的耐受性[7]。再者，研究表明膠質瘤的發展與局部免疫抑制機制有重要的聯系[8]。上述結果發現實驗組經吸入性麻醉藥物異氟醚干預后能夠抑制NF-κB p65的表達，而且能夠減少腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6從而達到負調控NF-κB信號的作用。

綜上，吸入性麻醉藥物異氟醚雖然不能中斷C57BL/6小鼠膠質瘤的發展，但卻能夠一定程度上抑制膠質瘤的快速生長，其作用機制主要是通過抑制NF-κB p65的表達，從而減少腦組織T輔助細胞炎癥因子起到負調控NF-κB的活化作用。然而，NF--κB還參與了細胞凋亡、增殖等其他細胞生物過程，為此我們尚需繼續深入探討吸入性麻醉藥的其他作用機制，為提高放化療療效與腫瘤個體化治療提供基礎研究依據。

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(收稿2015-12-20)

廣州醫科大學青年項目：2013A38 ；廣州市屬高校科研項目：1201430219

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1673-5110(2016)21-0057-03