腦膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達與臨床病理特征的關系

李 萍 鄧 飛 周 薇 陶靜莉 王 艷

南方醫科大學深圳醫院病理科 深圳 518000

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腦膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達與臨床病理特征的關系

李 萍 鄧 飛 周 薇 陶靜莉 王 艷

南方醫科大學深圳醫院病理科 深圳 518000

目的 探究腦膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達與臨床病理特征的關系，觀察其對腦膠質瘤患者預后中的研究價值。方法 選取2007-05—2012-03在河北省人民醫院就診的76例膠質瘤患者和24例腦組織正常患者，對其采用實時定量PCR和微陣列芯片法(microarray chip)檢測微小RNA-184表達，同時對膠質瘤患者的無病生存期及總生存期情況采用乘法極限估計法(Kaplan-Meier)進行分析。結果 膠質瘤患者石蠟包埋組織中微小RNA-184表達下降，采用實時定量PCR對其進一步驗證。KPS評分、WHO分級、生存時間及復發時間與微小RNA-184的低表達顯著相關。乘法極限估計法分析結果顯示，微小RNA-184高表達患者的無病生存期和總生存期與微小RNA-184低表達患者比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。多因素分析結果表明，微小RNA-184的表達差異是預測無病生存期和總生存期的獨立危險因素。結論 膠質瘤患者預后和微小RNA-184的表達密切相關，在預測膠質瘤患者預后情況中微小RNA-184可作為獨立的標志物。

微小RNA-184；膠質瘤；臨床病理；實時定量PCR

腦膠質細胞瘤是原發性中樞神經系統腫瘤中最為常見的一種腫瘤，放化療和手術對其均起不到理想效果，患者預后情況較差。目前，對于膠質瘤的研究熱點主要體現在尋找其有效的靶標分子及預后標志物[1]。研究發現，舌鱗狀細胞癌、混合性膠質瘤、神經上皮細胞腫瘤、星形細胞瘤等腫瘤的發生和進展與微小RNA-184密切相關[2]。然而腦膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達與臨床病理特征的關系仍少見報道。為此，本研究觀察了微小RNA-184在正常腦組織及膠質瘤中的表達，分析微小RNA-184與臨床病理特征和預后的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1．1 病例選擇 選取2007-05—2012-03在我院就診的76例腦膠質瘤石蠟包埋組織患者為研究對象，年齡20～75歲。入選患者均經病理證實并首次進行手術治療，術前均未行放化療。76例患者年齡(50.7±4.2)歲，男60例，女16例。卡氏評分<80分59例，≥80分17例。根據2007年WHO神經系統腫瘤分類標準對患者的腫瘤組織分級，其中Ⅰ級8例，Ⅱ級17例，Ⅲ級35例，Ⅳ級16例。同時選取24例行腦外傷行內減壓的正常腦組織患者為對照。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。

1．2 RNA的濃度測定 采用Trizol法從腦組織中提取總RNA，抽提試劑由北京索萊寶科技有限公司提供，使用ND2000超微量分光光度計對總RNA濃度進行測定，儀器由北京科爾德科貿有限公司提供。RNA提取及濃度測定均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1．3 微小RNA微陣列芯片法檢測 為研究正常腦組織和膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184的表達，實驗中選取4例正常腦組織和4例膠質瘤的石蠟包埋組織，使用晶芯微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司)進行檢測。根據操作說明進行掃描、洗滌、加多聚A尾、染色、雜交等操作。采用Affymetrix基因芯片技術對陣列圖像進行分析以便獲得原始數據，選擇GeneSpring基因表達數據分析軟件對數據進行分析。探針含有所有樣品均有的基團必須≥1，使用“P”進行標識用作更精確的數據分析。比較P值能夠確定微小RNA的表達差異，基因上調及下調的統一標準是P≤0.05。

1．4 實時定量PCR檢測微小RNA-184表達 為了對微陣列芯片法分析中微小RNA表達變化進行驗證，采用實時定量PCR對正常腦組織及膠質瘤中微小RNA-184表達進行檢測，內參選用RUN6B。微小RNA-184和RUN6B的引物由上海華津生物科技有限公司合成。

1．5 隨訪情況 從接受手術日起，對受試者進行每3月一次的定期隨訪，隨訪資料同步更新。末次隨訪時間為2015-06-24。其中6例由于聯系方式發生變化而導致失訪，其余70例隨訪時間為7～30個月。

1．6 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件分析。采用秩和檢驗或曼-惠特尼U檢驗對微小RNA-184表達和臨床病理特征間的關系進行分析。采用時序檢驗和乘法極限估計法分析生存曲線。采用Cox分析多因素和單因素，對生存期和臨床病理特征的相關性評價選用HR和CI。α=0.05作為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 實時定量PCR檢測微小RNA-184表達 對24例正常腦組織和76例膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184的表達采用實時定量PCR進行檢測。結果顯示，微小RNA-184在正常腦組織的相對表達量為(7.31±1.79)，膠質瘤為(2.84±0.85)，2組微小RNA-184的表達量比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2．2 微陣列芯片分析結果 選取4例正常腦組織和4例膠質瘤的石蠟包埋組織進行微陣列芯片分析，分析結果表明膠質瘤中微小RNA-184的表達下調，與實時定量PCR檢測結果一致(P<0.05)。

2．3 臨床病理特征與微小RNA-184表達的相關性 對臨床病理變量及微小RNA-184的表達進行比較發現，KPS評分、生存時間、WHO分級和復發時間與微小RNA-184表達之間存在明顯的相關性，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2．4 總生存期和無病生存期與微小RNA-184的關系 分析性別、年齡、腫瘤大小、輔助治療、WHO分級等影響因素，觀察膠質瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達的對患者預后作用。見表2。時序檢驗結果表明，膠質瘤微小RNA-184低表達患者無病生存期較高表達患者更短，差異具有統計學意義(P<0.05)；膠質瘤微小RNA-184低表達患者總生存期較高表達患者更短，差異具有統計學意義(P<0.05)。對無病生存期和總生存期進行多因素回歸分析，結果表明，KPS評分、WHO分級和微小RNA-184的表達與總生存期具有明顯相關性。WHO分級、微小RNA-184表達和KPS評分與無病生存期具有明顯相關性。見表3。

表2 單因素Cox分析膠質瘤患者的無病生存期和總生存期

表3 多因素Cox分析膠質瘤患者的無病生存期和總生存期

3 討論

微小RNA是一種非編碼RNA，長度約為22個核苷酸。微小RNA對蛋白的合成具有抑制作用，從而能有效發揮自身的生物學功能。通常惡性腫瘤患者的微小RNA會出現功能失調，這表明肺癌、膠質瘤及乳腺癌等惡性腫瘤與其功能失調具有密切聯系[3]。

隨著腫瘤相關微小RNA的研究逐漸增多，腦膠質瘤中微小RNA的作用及分布也逐漸被越來越多的人所了解，膠質瘤組織中的微小RNA表達異常，干細胞生成、細胞存活、分化及腫瘤血管生成等膠質瘤的生物學行為與微小RNA的異常表達密切相關[4]。研究發現，膠質瘤細胞中的miR-222、miR-21等23種微小RNA表達上調；而miR-128、miR-7等34種則下調[5]。本次研究中采用微陣列芯片法對膠質瘤中微小RNA-184的表達進行檢測，結果發現正常腦組織中微小RNA的表達高于膠質瘤，同時采用實時定量PCR法對微陣列芯片法的檢測結果進行驗證，發現兩種不同的方法檢驗結果相一致。這提示膠質瘤的發生及發展可能與微小RNA-184表達下調有關。此外，本研究中發現總生存期、WHO分級、復發時間及KPS評分等因素與膠質瘤中微小RNA-184的表達具有密切聯系，這表明膠質瘤中微小RNA-184可能具有抑制作用。微小RNA-184能夠對凋亡前基因及抑癌基因等多靶點起到調節效果，從而產生癌基因作用；其能夠對胞外細胞起靶向結合作用，調節激酶1基因轉錄產物的3’UTR，抑制細胞外調節蛋白激酶1蛋白的產生，從而對膠質瘤增殖發揮抑制效果。通過本次研究，微小RNA-184的內在機制可能是：(1)微小RNA-184低表達能夠作用于靶基因從而對細胞生長起到促進作用并提高其生存能力；(2)微小RNA-184低表達能夠對靶基因上調，對膠質瘤的侵襲性具有促進作用[6]。

此外，有研究發現，膠質瘤的進展可能與特定微小RNA表達異常有關，通過對微小RNA-184檢測能夠對膠質瘤的預后起到預測作用[7]。本次研究發現，微小RNA-184表達水平越高其預后也越好，同時Cox回歸分析表明，不良無病生存期和總生存期密切相關的預后因素是微小RNA-184的低表達，從而能夠證實在預測膠質瘤的預后中可以將其作為分子標志物。其機制可能是微小RNA-184能夠對細胞生存產生抑制作用，而當微小RNA-184表達下調時就能抑制細胞凋亡，促進細胞生長，進而使得患者的預后較差[8]。

綜上所述，膠質瘤患者預后和微小RNA-184的表達密切相關，在預測膠質瘤患者預后中微小RNA-184可作為獨立的標志物。

[1] 鄭立影，呂紅，林賦桂，等．腦膠質瘤治療策略及其研究進展[J]．吉林醫藥學院學報，2016，37(1)：50-53．

[2] 郎博娟，馬金陽，胡余昌，等．膠質瘤中MicroRNA-184的表達及其預后價值[J]．腫瘤防治研究，2015，42(5)：483-487．

[3] Selitsky SR，Dinh TA，Toth CL，et al．Transcriptomic Analysis of Chronic Hepatitis B and C and Liver Cancer Reveals MicroRNA-Mediated Control of Cholesterol Synthesis Programs[J]．mBio，2015，6(6)：e01 500-1 515．

[4] 陳圖南，易良，李飛，等．人原代膠質瘤起始細胞的生物學行為初步研究[J]．中國臨床神經外科雜志，2012，17(6)：347-350；357．

[5] 王宏勤，李晉虎，苗旺，等．多發與單發性膠質瘤患者石蠟包埋組織中微小RNA差異表達的初步探討[J]．中華神經外科雜志，2015，31(5)：519-523．

[6] 郭紅寶，南陽，甄英偉，等．微小RNA-451對人腦U87膠質瘤細胞株增殖和侵襲影響機制的研究[J]．中華神經外科雜志，2015，31(12)：1 263-1 267．

[7] 馬金陽，陳謙學．微小RNA-145在膠質瘤中的表達及其臨床意義[J]．中華實驗外科雜志，2014，31(9)：1 871-1 873．

[8] 戚貴軍，陳步東，張春智，等．惡性膠質瘤患者預后與微小RNA-221和微小RNA-222表達的關系[J]．中華實驗外科雜志，2012，29(7)：1 394-1 395．

(收稿2016-04-02)

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1673-5110(2016)21-0059-03