固定反硝化菌強化人工濕地處理低污染水研究

林 燕，張煥杰，劉 曦，俞 璐，朱文穎，孔海南

（上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240）

固定反硝化菌強化人工濕地處理低污染水研究

林 燕，張煥杰，劉 曦，俞 璐，朱文穎，孔海南*

（上海交通大學環境科學與工程學院，上海 200240）

將固定反硝化菌Pseudomonas stutzeri（以聚乙烯醇、海藻酸鈉為材料包埋固定）投加至人工濕地不同位置，進行低污染水模擬脫氮實驗，以探究固定反硝化菌的最佳投加位置；采用高通量測序技術分析各系統微生物組成，并考察最優系統在低溫下的脫氮效果。結果表明，上層投加固定反硝化菌對濕地脫氮的強化效果最佳，TN與NO-3-N去除率分別為60.31%與64.98%；微生物多樣性指數顯示，投加固定反硝化菌雖降低了系統微生物豐富度，但各處理系統內主要微生物物種差異不大，Proteobacteria（變形菌門）豐度最高，投加固定反硝化菌系統中Nitrospira（硝化螺旋菌門）比例增大，有利于脫氮效果的提高。在15℃條件下，上層投加固定反硝化菌系統的TN與NO-3-N去除率分別為50.86%與55.06%，高于空白濕地系統（TN與NO-3-N去除率為24.81%與27.53%）。

固定化；人工濕地；脫氮；微生物多樣性

近年來，人工濕地被廣泛用于流域水體及污水廠尾水等的處理[1-2]，但其脫氮效率受氣溫影響較大，低溫時脫氮效果不佳[3-4]，且脫氮過程中產生的NO-2-N積累對微生物產生毒害作用而阻礙生物脫氮[5]等。固定化微生物技術具有環境適應能力強、耐毒害能力強等優點[6-7]，可彌補濕地脫氮的不足，強化脫氮效果。張永棟等[8]進行的聚乙烯醇凝膠包埋方法固定化細菌聯合植物的除氮研究，唐美珍等[9]進行的Pseudomonas flava WD-3固定化技術及其強化SBR污水處理的應用研究，張會萍等[10]進行的陶粒固定化脫氮菌群對景觀水中NO-3-N的去除研究，都證實了該強化技術的可行性。但對于固定化脫氮菌投加至人工濕地時投加方式的研究尚少，且大多研究是對強化結果的考查，而對強化原因的分析較少。

本研究考查了固定化反硝化菌投加至濕地系統時，不同投加位置（上層、下層、上下層）對系統低污染水脫氮效果的影響，采用高通量測序技術從微生物層面分析強化原因，并考察其在低溫下的系統脫氮強化效果。

1 材料與方法

1.1 固定化反硝化菌

菌種：Pseudomonas stutzeri A1501（序列號為NR_ 074829.1），實驗室分離所得。

固定化材料：聚乙烯醇（PVA）、海藻酸鈉（SA）。固定化方法：硼酸包埋法。

固定化顆粒：密度為0.93 g·mL-1，平均1 g固定化顆粒中所含反硝化菌質量為0.02 g。

1.2 進水水質

人工濕地系統進水為人工模擬低污染水，其主要污染物為NO-3-N和COD，由自來水與KNO3、葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O等試劑配制而成。相關水質參數見表1。

表1 人工濕地系統進水水質參數（mg·L-1）Table 1 Properties of the influent of CWs（mg·L-1）

圖1 實驗室模擬人工濕地裝置Figure 1 Constructed wetlands at pilot scale

1.3 實驗裝置及運行

實驗室模擬水平潛流人工濕地系統裝置如圖1所示。材質為聚氯乙烯，尺寸為0.8 m（長）×0.25 m（寬）×0.7 m（高），總容積0.14 m3，內部填充8～12 mm粒徑礫石，填充高度0.50 m，有效水深0.45 m。濕地植物為蘆葦，種植密度為40株·m-2，種植前置于10%修正的Hoagland培養液中生長一周[10]。系統采用連續運行方式，流量為20 L·d-1，水力停留時間為2.0 d。

1.3.1 固定化反硝化菌的投加位置實驗

固定化反硝化菌的投加位置主要為濕地上下兩層（均勻投加，三組濕地系統固定化反硝化菌的投加總量相同），分別設在填料表面下10 cm與35 cm處。各系統均在25℃條件下運行（人工氣候室控制）。根據各系統中投加位置的不同，實驗設置4組處理系統：第一組為空白（處理系統1）；第二組為下層投加固定化反硝化菌（處理系統2）；第三組為上層投加固定化反硝化菌（處理系統3）；第四組為上下層均投加固定化反硝化菌（處理系統4）。

1.3.2 固定化反硝化菌對人工濕地脫氮的強化實驗

為探究固定化反硝化菌在低溫下（15℃，人工氣候室控制）對人工濕地脫氮的強化效果，根據1.3.1的實驗結果，設置以下兩組處理系統：第一組為空白（處理系統1）；第二組為投加固定化反硝化菌強化人工濕地脫氮效果最佳的處理系統（由1.3.1實驗確定）。比較分析不同處理系統中TN的去除效果。

1.4 測試方法

微生物多樣性分析：高通量測序平臺（Illumina-Miseq 2×300 bp），微基生物科技有限公司。

2 結果與分析

2.1 投加位置對人工濕地處理系統脫氮的影響

2.1.1 各人工濕地處理系統脫氮效果分析

由圖2可知，在各人工濕地系統運行的前28 d，各處理系統出水TN濃度隨進水TN濃度的變化而波動，但上下層均投加固定化反硝化菌的濕地系統出水TN濃度變化較小，投加固定化反硝化菌的三組強化濕地系統對TN的去除效果優于空白濕地系統。這主要是因為投加反硝化菌減少了濕地系統啟動及脫氮微生物群落形成的時間。在運行的第28～50 d，各處理系統出水TN濃度均維持在相對穩定水平，空白濕地TN去除率較前階段提高，出水TN濃度與下層投加反硝化菌濕地相差不大，說明隨著系統的連續運行，空白濕地內植物逐漸適應系統環境并開始穩定生長，由此可見人工濕地內進行污染物去除的主要復合生態系統：基質-微生物-植物形成并穩定發揮作用。

由圖2和圖3可以看出，各人工濕地處理系統在進水TN濃度為3～5 mg·L-1、NO-3-N濃度為3～4 mg· L-1的條件下，處理系統3對TN的去除效果最好，即上層投加固定化反硝化菌對人工濕地脫氮的強化效果最佳，其TN去除率可達60.31%，優于處理系統1（空白對照人工濕地系統TN去除率為37.24%）、處理系統2（下層投加固定化反硝化菌TN去除率為44.35%）和處理系統4（上下層均投加固定化反硝化菌TN去除率為57.74%）。

圖2 各處理系統對TN去除效果Figure 2 Total nitrogen removal efficiency in CWs

圖3 各處理系統出水與濃度變化Figure 3 Changes of nitrite and nitrate concentrations in effluent of CWs

綜合各處理系統出水TN濃度以及TN去除率來看，投加固定化反硝化菌的位置不同，對人工濕地脫氮的強化效果也不同，裝置運行前期上層投加固定化反硝化菌系統的TN去除率最高，運行后期上層投加與上下層均投加固定化反硝化菌系統的TN去除率差別不大。分析其原因，主要有以下兩點：

第一，潛流人工濕地內的水流分布特性顯示，當進水口位于人工濕地基質表層，出水口位于與進水口平行高度處時，進入人工濕地的污水首先流經靠近濕地進水口上層部分，該處投加固定化反硝化菌對強化人工濕地脫氮效果最明顯，孔德川等[15]用CFD Fluent多孔介模型對分層式潛流人工濕地內部的流場進行模擬的分析結果表明（圖4），進入人工濕地的污水水流分布主要在進水口區、出水口區以及人工濕地的底層區域。若據此來看，濕地下層投加固定化反硝化菌對脫氮的強化效果應為最佳，但濕地下層流速較快，水流流經下層時停留時間較短，且流經濕地上層的水體中NO3--N去除效果較差，從而使系統整體出水TN濃度偏高。因此，在投加位置的選擇上，上層投加與上下層投加均為較好的方式。

圖4 人工濕地潛流流線圖Figure 4 The contour of stream function of the subsurface flow wetland

第二，在本實驗中濕地上層是植物根系生長的主要區域，發達的根系不僅為微生物生長提供了依附介質和環境，而且植物根系的分泌物和脫落物能夠為微生物提供生長所需的營養物質和反硝化作用所需的碳源。Salvato等[16]及Henry等[17]研究表明植物根際分泌物對反硝化作用起到促進作用。這主要體現在三方面：NO3--N含量、根際溶解氧的量和根際可溶性有機碳量。植物的同化作用，使得植物根際附近的NO3--N含量降低；植物根系的呼吸作用使根際附近氧分壓降低，以利于反硝化作用的進行；植物根系在代謝過程中會向外釋放分泌物，其中的有機可溶性物質包括碳水化合物氨基酸、維生素和有機酸，可供植物吸收利用，并為根際微區中的微生物提供能源。因此，上層投加固定化反硝化菌具備反硝化作用所需的良好條件，反硝化作用較強，從而對強化人工濕地脫氮效果較明顯。

表2 各濕地處理系統的反硝化強度（mg·kg-1·h-1）Table 2 Denitrification intensity in different CWs（mg·kg-1·h-1）

2.1.2 各人工濕地處理系統反硝化強度分析

由表2所示的反硝化強度結果可知，處理系統運行10 d時，在人工濕地系統上層，處理系統3與上下層均投加固定化反硝化菌的處理系統4反硝化強度明顯強于處理系統1與處理系統2；在人工濕地系統下層，下層投加固定化反硝化菌的處理系統2與上下層均投加固定化反硝化菌的處理系統4反硝化強度明顯強于處理系統1與處理系統3。顯然，這主要是由于向人工濕地系統投加反硝化菌而產生的結果。但隨著系統運行時間的增加，處理系統3與處理系統4內無論上層還是下層的反硝化強度的差異逐漸縮小，說明隨著系統的運行，濕地植物的生長以及濕地微生物的繁殖，人工濕地處理系統3與4內的反硝化菌數量接近。這與2.1.1所得的處理系統3與處理系統4在運行的28～50 d，TN、NO-3-N的去除效果相差不大這一結論一致。

綜合表3可見，不同位置處投固定化反硝化菌對各系統中不同位置處溶解氧濃度的變化雖有一定的影響，且投加固定化反硝化菌的各系統出水溶解氧濃度均低于空白對照組系統，但投加固定化反硝化菌的各系統溶解氧濃度的變化并未影響對系統的強化脫氮效果。

值得一提的是，處理系統2下層的反硝化強度在系統運行的整個過程中一直保持較高的水平，但其出水結果顯示的TN及NO-3-N去除率并不高。一方面這是由于濕地內水流分布的原因，另外，實際上反硝化強度的測定結果不僅與基質微生物數量有關，測定條件及測定過程中的碳源種類及數量也產生了重要的影響。

2.1.3 各人工濕地處理系統微生物多樣性分析

采用高通量測序技術，根據barcode序列區分各個樣品數據。樣品1、2、3、4（分別對應系統1～4）中所獲得的優化有效序列條數分別為14 057、13 545、15 989、14 350條；在97%的相似水平下，對取自4個處理系統樣品的測序結果進行多樣性指數分析，具體結果如表4所示。4個樣品可分別劃分為6682、6408、6504、5821個OTUs。對比分析Chao、Ace以及Shannon值可以得出，樣品1中該3個指數值最大，可以說明空白對照組人工濕地系統中的微生物物種多樣性最高，群落豐富度大；而樣品4中該3個指數值最小，說明上下層均投加固定化反硝化菌的人工濕地系統中的微生物物種多樣性最低，群落豐富度小。

對比分析4個樣品的Simpson值可以得出如上相同結論。

對4個處理系統樣品以門水平進行微生物群落結構分析可知，4組樣品所包含的微生物門類差異不大，均包含Proteobacteria（變形菌門）、Chloroflexi（綠彎菌門）、Nitrospira（硝化螺旋菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）等，且4組樣品中所占的比例最大，即豐度最高的微生物均為Proteobacteria（變形菌門），其次為Chloroflexi（綠彎菌門），其他微生物門類在各自處理系統中所占的比例有所不同，如圖5所示。分析對比圖6可知，對于處理系統1與處理系統2來說，Acidobacteria（酸桿菌門）的豐度高于Bacteroidetes（擬桿菌門），也高于Nitrospira（硝化螺旋菌門），而處理系統3與處理系統4中所包含的Acidobacteria（酸桿菌門）與Nitrospira（硝化螺旋菌門）的比例相差不大，但均大于Bacteroidetes（擬桿菌門），另外各處理系統中的微生物群落所占門類還包括Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Chlorobi（綠菌門）等。

表3 各濕地處理系統水體溶解氧濃度（mg·L-1）Table 3 Dissolved oxygen in different CWs（mg·L-1）

表4 指數分析結果Table 4 Index analysis statistics

Proteobacteria（變形菌門）是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等著名的種類。但其中所包含的自由生活的種類，如β-變形菌中無機化能種類，如可以氧化氨的Nitrosomonas（亞硝化單胞菌屬），γ-變形菌中的Vibrionaceae（弧菌科）和Pseudomonadaceae（假單胞菌科）等，對生物的脫氮過程都起著重要的作用。本實驗中，用于強化人工濕地脫氮效果而投加的固定化反硝化菌即為Pseudomonas（假單胞菌屬）。從圖6可看出，處理系統3與處理系統4中微生物群落所含Proteobacteria（變形菌門）多于處理系統1與處理系統2，結合以上對于4個處理系統脫氮效果的分析，恰好說明投加固定化反硝化菌能夠強化人工濕地脫氮效果的原因之一，即為投加的高效反硝化菌在人工濕地微生物反硝化作用中起到重要作用。

圖6中所示的Nitrospira（硝化螺旋菌門）在處理系統3與處理系統4中所占的比例大于其在處理系統1與處理系統2中所占比例。通過對該門類細菌的分析表明，Nitrospira（硝化螺旋菌門）是一類革蘭氏陰性細菌，其中的Nitrospira（硝化螺旋菌屬）作為硝化細菌（Nitrifier），可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，系統微生物群落中的該菌群增多，可減少的積累，從而減輕積累對系統脫氮微生物的毒害作用，以利于反硝化作用的進行，提高人工濕地系統整體的脫氮效果。

圖5 環形發育樹Figure 5 Phylogenetic tree

圖6 門水平物種分布柱狀圖Figure 6 Microbial community barplot at phylum level

圖7所示為對4個處理系統樣品以屬水平進行的微生物群落多樣性分析。由圖可知，4個處理系統所包含的主要微生物種類差異不大，但各菌屬所占比例各有不同，Pseudomonas（假單胞菌屬）在處理系統2、處理系統3與處理系統4中所占比例均大于其在處理系統1中所占比例。這說明，投加至人工濕地系統的反硝化菌得以較好地生長繁殖，但從各處理系統出水的脫氮效果來看，處理系統2中，Psedomonas（假單胞菌屬）的增多并未在很大程度上強化系統脫氮效果，而處理系統3與處理系統4脫氮效果卻得以加強。從微生物方面分析其原因，可以發現，在處理系統3與處理系統4中，與Psedomonas（假單胞菌屬）所占比例同樣增加的菌屬還包括Thioalkalispira（硫堿桿菌屬）與Nitrospira（硝化螺旋菌屬），而Nitrospira（硝化螺旋菌屬）的存在可以與反硝化菌形成一個完整的硝化-反硝化的脫氮微生物體系。

圖7 屬水平物種分布柱狀圖Figure 7 Microbial community barplot at genus level

2.2 低溫下投加固定化反硝化菌對人工濕地脫氮的強化效果

根據2.1所得結果，將固定化反硝化菌強化人工濕地脫氮在低溫（15℃）下進行，該實驗分兩組：第一組為空白（處理系統1）；第二組為上層投加固定化反硝化菌（處理系統3）。比較分析不同處理系統中TN、的去除效果。

由圖8和圖9可以看出，2.1中脫氮效果最好的處理系統3，在轉為15℃的條件下，依然具有優于處理系統1的脫氮效果。在進水TN及濃度范圍不變的條件下，處理系統1與處理系統3的TN去除率分別可以達到24.81%和50.86%的去除率分別可以達到27.53%和55.06%。對比2.1中實驗結果，當溫度由25℃降至15℃時，處理系統1與處理系統3的TN去除率分別降低了12.43%和9.45%，的去除率分別降低了23.15%和9.92%，顯然，固定化反硝化菌所具有的耐低溫性能在投加至人工濕地系統后同樣體現了優勢。由圖8和圖9還可以看出，隨著系統運行時間的增加，投加固定化反硝化菌的人工濕地系統對氮素的去除率也增加。這表明，固定化反硝化菌不但具有耐低溫性能，而且隨著對低溫環境的適應，能夠表現出較好的脫氮性能。

由圖9可以看出，在15℃的運行條件下，空白對照組濕地系統與上層投加固定化反硝化菌的濕地系統出水濃度相差不大，說明固定化反硝化菌的投加不會增加處理系統脫氮中的積累。綜合2.1.1中對兩處理系統TN去除率的結果分析可以得出，在處理系統3脫氮效果優于處理系統2的同時（二者TN去除率分別為50.86%和24.81%），兩處理系統出水濃度相差不大。這說明，在低溫條件下，固定化反硝化菌的投加也能夠相對減少人工濕地系統脫氮過程中的積累，從而對系統的脫氮效果起到強化作用。

3 結論

在實驗裝置運行的50 d內，處理系統1、2、3、4的TN去除率分別達37.24%、44.35%、60.31%、57.74%。投加固定化反硝化菌強化了人工濕地脫氮效果，其中，上層投加固定化反硝化菌對人工濕地脫氮的強化效果最佳。

圖8 各處理系統對TN去除效果Figure 8 Total nitrogen removal efficiency in CWs

圖9 各處理系統出水和濃度變化Figure 9 Changes of nitrite and nitrate concentrations in effluent of CWs

不同位置處投加固定化反硝化菌對濕地系統中微生物多樣性產生不同程度的影響，但各處理系統間微生物群落多樣性總體差異不大，均為Proteobacteria [變-6yChloroflexi（綠彎菌門）]所占比例最大，且上層與上下層均投加固定化反硝化菌的濕地系統出現的微生物群落多樣性的細微變化，如Nitrospira（硝化螺旋菌門）所占比例增大，反而有利于提高系統脫氮效果。

在15℃條件下，上層投加固定化反硝化菌的濕地TN去除率可達50.86%，高于空白對照組濕地，說明固定化反硝化菌所具有的耐低溫性能在投加至人工濕地系統后同樣表現出較好的脫氮性能。

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Performance of immobilized denitrifying bacteria in constructed wetland for slightly-polluted water treatment

LIN Yan,ZHANG Huan-jie,LIU Xi,YU Lu,ZHU Wen-ying,KONG Hai-nan*
（1.School of Environmental Science and Engineering,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China）

Denitrifying bacteria Pseudomonas stutzeri isolated from lab were fixed with PVA and SA and were added to dosing positions（upper,lower,upper and lower）to simulate the release of the nitrate-rich source in low pollution water,aiming to determine the optimal dosing position.The reasons of enhanced nitrogen removal in microbial community diversity were analyzed by using high-throughput sequencing technology,and the effect of strengthening efficiency at low temperature was investigated.Results showed that the system dosing in upper layer got the best performance,and the removal rates of total nitrogen and nitrate were 60.31%and 64.98%,respectively.The results of microbial diversity index of each system showed that the microbial species diversity in the control system was higher than othes.But overall, there was little difference between the four systems,and the most abundant phylum was Proteobacteria in each system.And the increased percentage of Nitrospirain dosing systems was conducive to improve the nitrogen removal.The results showed that the removal rates of total nitrogen and nitrate in the system dosing in upper layer were 50.86%and 55.06%,respectively,while that in the control system were 24.81%and 27.53%at 15℃.

immobilization;constructed wetland;denitrification;microbial diversity

X52

A

1672-2043（2016）11-2154-09

10.11654/jaes.2016-0540

2016-04-19

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2012ZX07105-003）

林燕（1976—）女，浙江寧波人，副教授，研究方向為水污染控制與生態修復。E-mail：linyan2002@sjtu.edu.cn

*通信作者：孔海南E-mail：hnkong@sjtu.edu.cn

林燕，張煥杰，劉曦，等.固定反硝化菌強化人工濕地處理低污染水研究[J].農業環境科學學報,2016,35（11）：2154-2162.

LIN Yan,ZHANG Huan-jie,LIU Xi,et al.Performance of immobilized denitrifying bacteria in constructed wetland for slightly-polluted water treatment[J]. Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2154-2162.