應用下一代測序技術對α地中海貧血進行胚胎植入前遺傳學檢測

謝美娟 鄧權衡 鄧紅輝 盧紹月 楊學習 馬強★

·論著·

應用下一代測序技術對α地中海貧血進行胚胎植入前遺傳學檢測

謝美娟1鄧權衡1鄧紅輝1盧紹月1楊學習2馬強2★

目的探討下一代測序（nextgeneration sequencing，NGS）技術在α地中海貧血胚胎植入前遺傳學檢測中的應用。方法選取2對α地中海貧血??SEA缺失型攜帶者夫婦體外受精胚胎活檢后的6個胚胎樣本應用全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）技術、下一代測序技術進行胚胎植入前遺傳學檢測，同時采用跨越斷裂點熒光PCR（gap?PCR）進行平行對照檢測。結果2個家系6個胚胎樣本的胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）結果分別為??SEA/ αα母源攜帶、??SEA/??SEA、??SEA/αα母源攜帶、??SEA/??SEA、??SEA/αα母源攜帶和??SEA/??SEA；胚胎植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS）結果分別為45，XX，?5、46，XX、46，XY、47，XY，+1、46，XX和46，XY，+1，?2；Family 1 gap?PCR檢測結果為父母均為SEA雜合子；E1為正常、E2為SEA純合子、E3為正常；Family 2檢測結果分別為：父母均為SEA雜合子；E4為SEA純合子、E5為正常、E6為SEA純合子。結論結果顯示利用NGS不僅可以檢測出23對染色體的核型，同時解決了單細胞擴增等位基因脫扣（allele drop?out，ADO）造成的假陽性和假陰性的風險，更具有市場潛力及應用前景。

下一代測序；α地中海貧血；胚胎植入前遺傳學診斷；跨越斷裂點熒光PCR

α?地中海貧血，是一組因α?珠蛋白鏈合成減少或不能合成、α?鏈/非α?鏈比例失衡為特征的遺傳溶血性血紅蛋白病。我國南方為α?地中海貧血的高發區，其攜帶率也高達8.53％［1］；其中以東南亞（??SEA）缺失型最為常見，其發生率為72.87％～82.87％［2］。α?地中海貧血與出生缺陷有密切關系，也給社會和家庭帶來了沉重的負擔，而目前，α?地中海貧血還沒有有效的根治方法，主要以預防為主。因此，采用植入前期胚胎篩查來阻斷患兒的出生極為重要。

胚胎植入前遺傳學檢測主要包括胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screening，PGS）2方面。PGD是在胚胎著床之前即對配子或胚胎進行遺傳物質分析，選擇沒有遺傳物質異常的胚胎移植，可以有效地阻斷患兒的出生；PGS是選擇染色體整倍體的胚胎進行移植，進而提高體外受精?胚胎移植（in vitro fer?tilization?embryo transfer，IVF?ET）技術的成功率。

隨著我國全面二孩政策的放開，高齡產婦數量猛增，再加上不孕不育率逐年上升，提高妊娠率和妊娠質量已經成為亟待解決的問題。目前，以PGD/PGS為代表的第三代試管嬰兒正是解決這些問題的關鍵技術［3?4］。此外，NGS具有高通量、自動化、低成本的特征，自2008年以來，全基因組測序費用呈指數級下降，使得NGS在PGD/PGS臨床上的應用得到迅速推廣。本研究采用NGS對α?地中海貧血進行胚胎植入前遺傳學檢測，探討NGS應用于PGD/PGS臨床檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

QIAamp?DNA M iniand QIAamp DNA Blood M ini Kits、The REPLI?g Single Cell Kit購自德國Qiagen公司；Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0、Ion PGM?Template OT2 200 Kit、Ion PGM?Sequenc?ing 200 Kit v2、Ion Personal Genome Machine?（PGM?）、Qubit?2.0均購自美國Life Technology公司；α?地中海貧血基因檢測試劑盒（gap?PCR法）購自中山大學達安基因股份有限公司；Nuclease?FreeWater購自美國Life Technologies公司；無水乙醇（分析純）購自廣州化學試劑廠。

1.2 研究對象

2個家系雙方均為α?地中海貧血??SEA缺失型雜合子夫婦經體外受精胚胎活檢后共6個胚胎囊胚期滋養外胚層細胞以及夫妻雙方外周血。

1.3 實驗方法

1.3.1 全基因組擴增、基因組DNA提取

使用The REPLI?g Single Cell Kit對6個胚胎囊胚期滋養外胚層細胞進行全基因組擴增；采用QIAamp?DNA M ini and QIAamp DNA Blood M ini Kits對2對夫婦的全血樣本進行基因組DNA提取；具體操作步驟參見說明書。

1.3.2 下一代測序

根據測序需要，使用Ion AmpliseqTMlibrary kit 2.0將擴增好的DNA構建成文庫DNA。PCR特異性擴增目的片段，在DNA片段兩端加上通用測序接頭，PCR擴增文庫DNA，磁珠純化去除雜質；建庫后使用Qubit?2.0測定文庫DNA的濃度；根據每個樣本測序數據需求量和測序深度確定文庫的混樣個數為10個進行模板制備，使用Ion PGM?Template OT2 200 Kit制備測序模板；然后進行陽性模板的富集即去除雜質及擴增失敗的測序模板；最后使用Ion PGM?Sequencing 200 Kit v2在PGM?上進行測序。

1.3.3 下一代測序數據分析

將上機測序得到的原始數據利用Tor?rent_Server_5.0_VM軟件去除接頭序列，通過Tor?rent Mapping A lignment Program（TMAP）軟件比對到人類基因組參考序列hg19上，通過sam tools統計覆蓋倍數，通過GATK calling SNP基因型分析，最后結合家系的SNP連鎖分析，構建單體型。

1.3.4 gap?PCR

將2對夫妻雙方外周血提取的基因組DNA以及6個胚胎全基因組擴增后的基因組DNA采用α?地中海貧血基因檢測試劑盒進行gap?PCR檢測，實驗操作、結果判讀參見說明書。

2 結果

表1 6個胚胎下一代測序結果匯總表Table 1 Results of 6 embryos detected by NGS

表2 Fam ily 1 PGD結果Table 2 PGD results of fam ily 1

2.1 下一代測序結果

本次研究收集2對地中海貧血攜帶者夫婦體外受精胚胎活檢的6個囊胚期滋養外胚層細胞以及2對夫妻雙方外周血基因組樣本進行下一代測序。下一代測序檢測結果匯總表見表1。

將夫妻雙方外周血測序數據及其各自的胚胎測序數據進行家系的SNP連鎖分析，構建單體型，進行結果的判斷，6例胚胎樣本中，PGD結果分別為E1：??SEA/αα母源攜帶；E2：??SEA/??SEA；E3：??SEA/αα母源攜帶；E4：??SEA/??SEA；E5：??SEA/αα母源攜帶；E6：??SEA/??SEA，詳見表2、表3。

表3 Fam ily 2 PGD結果Table 3 PGD resultsof family 2

表4 2種檢測方法結果比對Table 4 The comparison results of PGD and gap?PCR

為提高IVF?ET的成功率，再將6個胚胎進行PGS檢測，PGS檢測結果分別為E1：45，XX，?5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，?2。詳見圖1、圖2。

2.2 gap?PCR檢測結果

為了驗證本次檢測結果的準確性，將2個家系樣本同時進行gap?PCR的檢測，Fam ily 1檢測結果分別為：父母均為SEA雜合子；E1為正常、E2為 SEA純合子、E3為正常；凝膠電泳圖結果見圖3；Fam ily 2檢測結果分別為：父母均為SEA雜合子；E4為SEA純合子、E5為正常、E6為SEA純合子；凝膠電泳圖結果見圖4。

2.3 2種檢測方法結果比對

將2種檢測方法的檢測結果進行對比，詳見表4。結果顯示對于SEA純合缺失樣本2種方法檢測結果一致，而經過WGA的PCR產物對SEA攜帶者則檢測結果為正常。

3 討論

目前α?地中海貧血SEA缺失型的檢測，文獻報道的PCR技術已比較成熟［5?6］。但PCR技術在PGD中仍然面臨著一些問題，如擴增偏倚和ADO等。ADO即一個細胞內來自雙親的2個等位基因只有一個擴增到可供檢測的水平的現象，是影響PGD準確性的主要因素之一。ADO的發生率為5％～20％［7?8］。其危害在于可導致雜合子胚胎的誤診，是PCR技術進行顯性遺傳病PGD可靠診斷的最大障礙。

本次實驗中共檢測2個家系4個外周血樣本及6例胚胎樣本。PGD結果分別為E1：??SEA/αα母源攜帶；E2：??SEA/??SEA；E3：??SEA/αα母源攜帶；E4：??SEA/??SEA；E5：??SEA/αα母源攜帶；E6：??SEA/??SEA；此外，在輔助生殖領域，染色體非整倍體也被認為是胚胎植入反復失敗的重要原因之一［9?10］。據文獻報道，約50％經IVF的胚胎存在染色體異常，約70％的IVF失敗由染色體異常導致［11?12］，因此為提高IVF?ET的成功率，將6個胚胎進行PGS檢測，PGS檢測結果分別為E1：45，XX，?5；E2：46，XX；E3：46，XY；E4：47，XY，+1；E5：46，XX；E6：46，XY，+1，?2；最后為了驗證本次檢測結果的準確性，將2個家系樣本同時進行gap?PCR的檢測。對比兩者結果發現，對于SEA純合缺失樣本2種方法檢測結果一致，而經過WGA的PCR產物對SEA攜帶者則檢測結果為正常，與PGD檢測結果不一致；這可能是由于在PCR過程中ADO所導致的［13］，而本研究采用WGA結合NGS，通過單體型的構建可以推斷出該胚胎2條DNA鏈的來源從而最終確定其是否攜帶致病基因；同時，通過低通量的全基因組測序來進行染色體核型的判斷，從而選擇核型正常且沒有致病基因的胚胎進行植入，進而提高體外受精的妊娠率、阻斷了地中海貧血患兒的出生。本研究結合WGA與NGS技術解決了樣本微量的問題以及ADO造成的假陽性和假陰性的風險；而且還可以準確判斷染色體非整倍體，更是解決了一些特殊基因不能直接診斷的局限性、樣本污染等問題。

NGS當前已經廣泛應用于無創產前診斷，同時也在PGD/PGS領域中應用。國內外均可見到NGS應用于PGD/PGS的報道。早期有報道稱PGS不能顯著提高植入率和活產率，這可能與早期的PGS技術主要是針對部分染色體異常進行檢測有關。Kung等［14］采用活檢的滋養外胚層細胞、卵裂球及已知的細胞系比較了NGS和微陣列比較基因組雜交（array?comparative genom ic hybridiza?tion，aCGH），結果顯示，NGS的敏感度和特異度均為100％。而早期PGD主要應用熒光原位雜交（fluoresence in situ hybridization，FISH）和PCR等技術，存在一定的局限性，Moutou等［15］報道了PCR?PGD的誤診率為0.15％，而FISH?PGD誤診率為0.06％。目前尚未見NGS進行PGD的誤診率的相關報道。PGD/PGS還存在另外一個重要方面的爭議是其子代的安全性問題，但目前尚缺乏大樣本、前瞻性隨機對照研究。無創胚胎染色體篩查（non?invasive chromosome screening，NICS）應運而生，該

新技術利用了游離在培養液中極微量的DNA，通過目前單細胞全基因組擴增技術實現對胚胎染色體的全面篩查，把從胚胎上提取細胞的活檢形式改革成從培養液中提取DNA的檢測形式，保護了胚胎樣本的完整性和安全性，但該技術目前尚不成熟，還存在著WGA擴增效率低下、培養液污染等問題，要真正普遍應用于臨床還有待進一步的探索。綜合各方面因素本研究建立了基于NGS的PGD/ PGS技術，它可以獲得基因組的全部信息，通過不同的檢測和分析策略，完全有可能實現對植入前胚胎從染色體異常檢測，到發現單基因突變甚至是新發突變等各個層面信息，同時該技術也可延伸到其他方面的臨床應用，如無創單基因病產前診斷、HLA配型、染色體易位正常和攜帶者的區分以及親子鑒定等，更具有市場潛力及應用前景。

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Successful preim p lantation genetic detection for alpha thalassaem ia by using next generation sequencing technology

XIEMeijuan1,DENG Quanheng1,DENG Honghui1,LU Shaoyue1,YANG Xuexi2,MA Qiang2★
(1.Guangzhou DaruiBiotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.Schoolof Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Objective To explore the application of next generation sequencing(NGS)for alpha?thalassem ia in preimplantation genetic detection.Methods 2 couplesw ith alpha?thalassem ia Southeast Asia deletion(??SEA deletion)and their embryos cells obtained after embryonic biopsy were selected to test by whole genome amplification(WGA)and NGS.Gap?PCR was done to all samples as a series of parallel tests. Results The PGD resultswere??SEA/αα,??SEA/??SEA,??SEA/αα,??SEA/??SEA,??SEA/ααand??SEA/??SEA,respectively.And embryosw ith the abnormalαgenewere confirmed from thematernal side according to genealogicalanalysis.The PGS results of 6 embryos from 2 familieswere 45,XX,?5;46,XX;46,XY;47,XY, +1;46,XX and 46,XY+1?2.Both husbands and w ives of the 2 families gap?PCR resultswere heterozygotes w ith??SEA deletion.The results of gap?PCR were normal in embryos 1,3 and 5 while??SEA deletion were

Next generation sequencing;A lpha thalassaem ia;Preimplantation genetic diagnosis; Gap?PCR

廣州市科技計劃項目健康醫療協同創新重大專項（201400000004?4）；廣州市重大科技攻關項目子課題（2014Y2?00220）；廣州市科技計劃產學研協同創新重大專項（201604020104）；廣東省科技計劃項目公益研究與能力建設專項（2015A030401040）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：馬強，E?mail：mqqqm2006@163.com

found in embryos 2,4 and 6 accordingly.Conclusion NGS not only can detect karyotype of 46 chromosomes but also avoid the risk of false positive and false negative caused by the allele drop?out(ADO) during the single cellamplification w ith a huge potentialmarketand w ide application prospect.