運用半導體測序法檢測4種遺傳病常見突變

王輝芳 梁志坤 葉倩平 楊旭

·論著·

運用半導體測序法檢測4種遺傳病常見突變

王輝芳1梁志坤1葉倩平1楊旭2★

目的運用基于半導體芯片技術的下一代測序方法對地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥和肝豆狀核變性病相關的38個常見致病突變位點進行基因測序，探討半導體測序技術在遺傳病檢測方面的應用價值。方法采用AmpliSeq方法通過多重PCR捕獲目的片段，然后構建文庫，用Ion Torrent ProtonTM測序儀進行測序反應，進而通過Sanger一代測序法進行結果比較驗證。結果33個樣本中共檢測出15例樣本存在功能性遺傳變異，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_ 46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例，Sanger一代測序結果與下一代測序結果完全一致。結論半導體測序能準確檢測該4種遺傳病常見突變，對遺傳病發病機制的研究及篩查具有一定的應用價值。

半導體測序；下一代測序；Ion Torrent ProtonTM；遺傳病；基因突變

地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥及肝豆狀核變性病為國內4種常見的高發遺傳病，嚴重影響我國出生人口素質。地中海貧血（thalas?semia）（簡稱“地貧”）是一組全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳病［1］。α?地貧發病相關基因為HBA2，β?地貧發病相關基因為HBB［2?4］。遺傳性耳聾是影響人類健康和致殘的常見病，據統計，新生兒中耳聾的發病率為1‰［5］，其中大約一半的耳聾與遺傳因素相關［6?7］，相關基因主要有GJB2、GJB3和SLC26A4等。苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是由于肝臟苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）缺乏所致的一種嚴重的遺傳性氨基酸代謝障礙性疾病，呈常染色體隱性遺傳［8］，該病可分為經典型PKU與非經典型PKU 2種類型［9?10］。苯丙酮尿癥是可治性的遺傳病之一，早期基因診斷可以盡早發現，應用飲食療法可以減輕或者控制患者癥狀［10］。肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD）是一種嚴重的常染色體隱性遺傳病，是由于細胞內銅代謝障礙造成胞內銅過多積聚，而引發的氧化應激反應導致細胞功能受損甚至細胞凋亡，其致病基因為ATP7B基因［11?16］。

當今社會，分子生物學發展迅速，用于檢測基因變異的方法多種多樣，包括有Sanger測序法、基因芯片法、液相芯片法、變性高效液相色譜分析法、MassARRAY分子量陣列技術、SNaP shot技術、高分辨融解法及高通量的下一代測序技術等。這些技術雖各有優缺點，但就整體而言，測序技術可更直接檢測基因序列，不僅可檢出已知的SNP位點，還可進一步發現出新的SNP位點，被廣泛用于基因檢測領域。

上述4種常見遺傳病都存在有臨床表現復雜，突變異質性高等特點，因此常規臨床診斷很難從根本上確診，從而延誤最佳治療時間。而近幾年高速發展的下一代測序技術，不僅可從基因水平上檢測出已知或未知的突變位點，而且克服了一代測序成本高、效率低的缺點，實現了快速、通量高的規模化測序［17?18］，為臨床診斷提供必要的依據。本研究擬采用高通量的半導體測序技術同時對上述4種遺傳病多個常見致病突變點進行檢測，探討半導體測序技術在遺傳病檢測中應用的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

實驗所用的全血基因組DNA樣本共33例，來自于福建醫科大學附屬協和醫院。33例樣本詳細信息見表1。

表1 樣本詳細信息Table 1 The detailed information of the samples

1.2 半導體測序方法

1.2.1 文庫構建

首先利用Ampliseq技術針對地中海貧血、遺

傳性耳聾、苯丙酮尿癥和肝豆狀核變性病4種遺傳病常見突變點設計引物，包含3個引物池，3個引物池分開進行多重PCR擴增，擴增體系為10μL，反應條件為：首先99℃預變性2m in；然后99℃變性15 s，60℃退火和延伸4m in進行16個循環數；最后10℃保存。擴增產物經FuPa酶消化引物，用DNA連接酶將特異性接頭序列連接在目的片段兩端，磁珠純化后進行一步擴增反應，最后經兩步磁珠純化去除較大或較小的片段，構建成片段大小在200 bp左右的基因文庫。Qubit?3.0熒光計對文庫濃度進行定量。

表2 38個常見突變點詳細信息Table 2 The details of 38 commonmutations

1.2.2 模板制備和模板富集

建好的文庫等量混合使每個文庫的終濃度為200 pmol/L，根據自己測序的flow數、片段大小以及芯片所能測的數據量等信息確定上樣量。用Ion Torrent OTTM進行乳液PCR擴增，將Ion PITMEnzyme M ix 120μL、Ion PITMISPs 100μL、稀釋好的文庫和無核酸酶水共400μL加入到PITMMaster M ix中，此時體積共2 400μL，震蕩離心后分3次勻速緩慢注入到Ion One TouchTMReaction Filter中，并注入200μL Ion One TouchTMReaction Oil，此過程避免注入氣泡，將Ion One TouchTMReaction Filter安裝在Ion One TouchTM2上，選擇相應程序進行反應。模板制備完成后用One TouchTMES進行模板富集。

1.2.3 Ion TorrentProton測序

用Ion Torrent ProtonTM測序儀進行測序反應，首先進行儀器的氯洗和水洗，然后更換初始化芯片進行初始化反應以調節各位置的pH值在一定范圍內，將ES制備的模板Loading在PI芯片上，安裝在測序儀相應位置，選擇預先設置好的Plan進行測序反應。測序結束后在Ion Torrent服務器上運行插件分析每個樣本的38個致病位點的突變情況。38個常見致病突變點詳細信息見表2。

1.3 Sanger一代測序驗證方法

將DNA樣本及相應的引物打包送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行Sanger一代測序驗證。

1.4 統計學方法

試驗結果統計分析選用符合方案數據，即所有符合試驗方案要求的受試者樣本數據進行統計分析，主要采用四格表整理試驗數據，陽性代表檢測出的含38個致病突變點的樣本，陰性代表沒檢測出38個致病突變點的樣本。半導體測序結果和Sanger一代測序驗證結果對比采用Kappa一致性檢驗。

試驗真實性評價：靈敏性、特異性、準確性、Kappa值等指標計算。

用下列公式計算：

靈敏性=A/（A+C）×100％

特異性=D/（B+D）×100％

準確性=（A+D）/（A+B+C+D）×100％

Kappa值采用SPSS 15.0統計軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 半導體測序結果

半導體測序結果顯示，33個樣本中共檢測出15例樣本存在突變，包含單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點、插入、刪除的8種突變，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例。檢測的每個堿基位點的Coverage在390～400，其中13例檢測突變頻率在42.5％～52.8％的為雜合突變型樣本，檢測突變頻率為100％的為純合突變型樣本。突變樣本檢測結果如表4。

2.2 Sanger一代測序驗證結果

采用Sanger測序法對檢測出的突變樣本的突變點進行驗證，結果與半導體測序結果完全一致。

2.3 統計學分析結果

根據檢測結果得知，A=15，B=0，C=0，D=18，靈敏性、特異性、準確性、Kappa值的計算結果都為1，結果表明，半導體測序結果與Sanger一代測序驗證結果完全一致。

3 討論

據估算遺傳病在活嬰中的發病率為23‰～25‰，但由于人口基數大，遺傳病種類多，總體患病人數將會是很大的數目，這無論是對家庭還是對社會都將造成嚴重的經濟和精神負擔［19］。且遺傳病在遺傳和臨床上都具有高度異質性，患兒出生后即使檢測出患有某種遺傳病也很難治愈，因此，積極開展對新生兒父母的遺傳病基因檢測或者胎兒產前檢測工作，對患者或者及時采取治療

并提供生育指導，選擇性終止異常胚胎妊娠，可有效防止患病胎兒的出生，并可在胚胎植入前選擇正常的胚胎植入，從而誕生出健康的胎兒。

表4 15例突變樣本檢測結果Table 4 The test results of 15mutational samples

基因測序是遺傳病檢測的重要手段，Sanger一代測序技術已成為分析基因序列的金標準，但卻因費用高、技術難度大等原因很難在基層推廣。而近年來以芯片測序、合成測序和焦磷酸測序為代表的下一代測序技術能彌補一代測序的不足，實現快速、通量高的規模化測序。以Ion Torrent PGMTM以及更高通量的Ion TorrentProtonTM測序儀為代表的半導體測序技術，其不屬于熒光檢測、核酸標記的生化技術，與其他下一代測序技術相比更簡單、性價比更高，并且具有強大的擴展性［20?21］。

本實驗中我們用Ion Torrent ProtonTM半導體測序儀對地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥以及肝豆狀核變性病常見的38個致病突變位點進行檢測，33個樣本中共檢測出15例樣本突變，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_ 46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例，檢測結果與Sanger一代測序驗證結果完全一致。成建等［22］應用IonTorrent半導體測序檢測了馬凡綜合征患者FBN1基因致病突變點，檢測到3個馬凡綜合征家系和1個馬凡綜合征的致病基因突變，并與Sanger驗證結果一致。周保成等［23］提取15例確診為經典型PKU患兒及其父母的外周血DNA，應用IonTorrent PGMTM進行測序檢測，共檢測出29個突變點，分屬17種突變，并發現p.P292L的新突變點，且該檢測結果與Sanger驗證結果一致。這些研究作為半導體測序技術應用于遺傳病檢測的強有力的證據，表明高通量的半導體測序技術應用于遺傳病檢測的可行性。

雖然半導體測序技術有諸多優點，但是我們也應認識到其自身的不足，如測序有單堿基誤差與靶基因目標區域的捕獲存在偏倚，導致少量假陰性的產生，這也是目前下一代測序的瓶頸問題，所以對檢測出的突變位點還應進行一代測序驗證。雖然如此，但半導體測序技術在遺傳病檢測方面的應用還是值得肯定的。同時，半導體測序技術在遺傳病檢測方面面臨著一些挑戰，主要體現在以下方面：（1）多數遺傳病遺傳機制復雜，遺傳異質性高，可能導致部分患者基因型和表型不相符。（2）已報道的致病位點雖然很多，但對患者篩查過程中，少部分病例檢測到的可能是一些不能解釋的未知突變點，這些突變點致病性還有待驗證，如何準確確定突變點與疾病的是否相關是目前遇到的又一難題。針對這些問題，筆者認為

可從以下方面進行解決：（1）改進及增強半導體測序信號傳導及轉換方式。（2）發展新型統計模型，優化生物學分析處理方法。（3）研究致病機制，搞清楚基因型與表型的關聯特征。（4）提升科研人員的專業水平，能認識實驗本身及儀器、方法等的不足，在實際操作過程中盡量避免錯誤，減小誤差。

隨著半導體測序技術的不斷發展，我們相信目前所面臨的難題將會逐步解決，更好的發揮半導體測序的優勢，在遺傳病檢測領域發揮更重要的作用。

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Detection of common mutations in 4 types of genetic disorders by sem iconduc?tor sequencing platform

WANGHuifang1,LIANG Zhikun1,YEQianping1,YANG Xu2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Basic Medical Sciences,Southern MedicalUniversity,Guagngzhou,Guangdong,China,510515)

Objective 38 common pathogenicmutationswhich are related to thalassemia,deafness, phenylketonuria and W ilson's diseasewere detected by using the nextgeneration sequencingmethod in order to evaluate the application value of Sem iconductor sequencing in the field of hereditary disease detection. Methods Targetgeneswere captured by AmpliSeq technology,whichmainly based onmultiple PCR,and the captured fragments were used for construction the DNA libraries,which were sequenced by using the Ion Torrent ProtonTMsequencing platform.Themutations were verified by Sanger sequencing.Results There werewere 15 samplesw ithmutations in 33 samples,and 8mutationswere detected.Among thesemutations,5 caseswerew ith HBB:52A＞T,3 casesw ith HBB:84_85insC,2 cases of HBB:45_46insG,1 case of HBB:2T＞G,1 case of GJB3:538C＞T,1 case of ATP7B:2333G＞T,1 case of GJB2:235delC,1 case of SLC26A4:IVS7?2A＞G. The results of Sanger sequencing were the same w ith the results of the next generation sequencing. Conclusion Semiconductor sequencing can detect the commonmutations of the 4 kinds of hereditary disease accurately,which can be used for mutation detection of these hereditary disease and to illum inate of the pathogenesisof these disorders.

Semiconductor sequencing;Nextgeneration sequencing;Ion Torrent ProtonTM;Hereditary disease;Genemutation

廣州市科技計劃項目（201504301001493）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司,廣東，廣州510665 2.南方醫科大學基礎醫學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊旭，E?mail：yangxu_kuaile@163.com