基于下一代測序平臺的結直腸癌KRAS基因檢測

李麗娟 羅婉珊 張家彬 王慶 吳英松

·論著·

基于下一代測序平臺的結直腸癌KRAS基因檢測

李麗娟1羅婉珊1張家彬1王慶1吳英松2★

目的基于下一代測序技術，檢測和分析結直腸癌KRAS基因的突變情況，以及評估其應用于臨床分子診斷中的可行性。方法應用Ion Proton半導體測序儀，檢測108例結直腸癌患者的石蠟包埋組織樣本的KRAS基因突變情況，并與作為金標準的一代測序檢測結果進行對比。結果下一代測序檢測結果與一代測序檢測結果基本一致，符合率為94％，靈敏度高達100％。結論通過對108例臨床樣本的檢測分析后，該下一代測序檢測方法可用于檢測結直腸癌KRAS基因突變情況。

下一代測序；結直腸癌；KRAS

RAS家族之一的KRAS基因位于12p12.1，編碼分子量為21 kD、具有GTP酶活性的p21蛋白［1］。KRAS為EGFR信號傳導通路RAS?RAF?MAPK中的重要因子。機體正常的KRAS基因，通過控制相關路徑抑制癌細胞的生長。突變型KRAS基因，在無需活化EGFR的條件下，激活下游信號傳導通路，導致細胞的生長、增殖和凋亡發生異常。細胞傳導信號的紊亂以及增殖的失控會導致細胞癌變。KRAS基因主要在第12、13位密碼子上發生突變，以點突變為主，在第61位密碼子上可見少數突變［2］。

KRAS是人體腫瘤中常見的致癌基因，其中20％～50％的結直腸癌患者伴有KRAS基因突變。其突變出現在結直腸癌的早期階段，不受治療的影響而維持穩定狀態［3］。KRAS是第一個對臨床治療結直腸癌的決策產生影響的生物標記物，是幫助了解相關基因和癌癥的發展預后、療效的關鍵指標。當KRAS基因為突變型時，則不建議采用

EGFR靶向藥物。臨床研究表明，當患者本身為KRAS基因野生型即不存在KRAS基因突變，服用EGFR有關靶向治療藥物，能獲得明顯的治療效果。例如非KRAS基因突變的結直腸癌患者，可受益于西妥昔和帕尼單抗等EGFR抗體藥物［4］。美國癌癥綜合網絡（National Comprehensive Can?cer Network，NCCN）提出腫瘤患者必須先檢測KRAS基因突變，再選擇EGFR靶向藥物。KRAS基因突變檢測已被NCCN列為《結腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項目。

目前，應用下一代測序技術檢測KRAS基因突變的方法有多種。本研究應用Ion Torrent半導體測序技術［5］，對108例結直腸癌病理樣本進行KRAS基因的突變檢測，并與一代測序檢測結果進行對比。旨在探討下一代測序檢測方法在臨床檢測結直腸癌KRAS基因突變的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

隨機選取2015年1月至2015年12月寧波市第二醫院結直腸癌患者的石蠟包埋組織樣本108例，其中男性64例，女性44例，年齡在32～90歲，平均年齡64歲。本研究經此醫院醫學倫理委員會批準，且患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

本研究主要使用的試劑見表1。

表1 試劑信息表Table 1 The information of reagents

表2 儀器信息表Table 2 The information of instruments

1.2.2 主要儀器

本研究主要使用的儀器見表2。

1.3 檢測方法

1.3.1 DNA提取

采用環保脫蠟劑對石蠟包埋組織樣本進行脫蠟處理，按照QIAamp DNA FFPE Tissue KIT（50）說明書提取樣本的DNA，用Qubit?3.0熒光定量儀定量。

1.3.2 文庫構建和定量

采用Ion AmpliSeq LibraryTMKit 2.0進行文庫構建。關鍵步驟包括：目的片段的PCR擴增反應，消除部分引物序列，加P1接頭和特異性接頭以及文庫的純化。

采用Qubit?3.0熒光定量儀進行文庫定量。根

據下列公式將文庫稀釋到200 pmol/L，稀釋后采用熒光定量PCR儀定量，等質量混合后進行模板制備。一次測序反應，最多可以混合96個不同特異性接頭的樣本（包括陽性質控品和陰性質控品）。

1.3.3 模板制備與富集

按照Ion PITMHi?QTMOT2 Reagents200 kit說明書進行操作，適量的上樣體積與ISP磁珠。關鍵步驟：通過反應過濾器形成油包水型，PCR擴增反應，離心回收制備好的模板顆粒，Ion One TouchTMES的磁珠技術分離得到陽性模板。

1.3.4 上機測序

采用Ion PITMHi?QTMSequencing 200 Kit，加入質控模板，退火，Loading測序芯片，加測序酶。108例樣本分2張芯片進行上機測序。

1.3.5 結果分析

利用測序儀配套服務器和軟件進行序列比對和分析。

運行VariantCaller和Coverage Analysis插件，得到樣本的分析結果。點擊“篩選”，在“Allele Call”選項中，篩選保留“Homozygous”和“Heterozygous”；在“Allele Source”選項中，篩選保留“Hotspot”；在“Frequency”選項中，篩選保留“≥5”的數值；在“Cov?erage”選項中，篩選保留“≥2500”的數值。

1.4 一代測序對照實驗

將上述提取的108例DNA樣本同時應用ABI 3500 DX基因分析儀及配套試劑進行檢測，運行SeqScanner程序，導入測序結果。按Find快捷鍵，查找序列“AGTTGGAGCT”。此序列往后的第1～6個堿基，分別為KRAS第12、13密碼子。12號密碼子野生型為GGT，13號密碼子野生型為GGC；否則為KRAS外顯子2突變，詳細見表3。

表3 突變信息表Table 3 The information ofmutations

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0統計分析軟件，對結果進行一致性檢驗，以Kappa≥0.75為一致性較好。

2 結果

2.1 測序結果分析

通過對108例結直腸癌石蠟包埋組織樣本測序結果分析，下一代測序結果檢出65例為KRAS基因野生型并與一代測序結果完全一致，有43例為KRAS基因突變型，其中37例KRAS基因突變型與一代測序結果完全一致，具體信息見表4。

下一代測序檢測結果中有6例KRAS基因突變型與一代測序結果不一致，見表5和圖1。

樣本NBE059、NBE071下一代測序結果顯示6.7％、9.4％的突變頻率；對應的一代測序峰圖突變堿基熒光信號弱（靈敏度＜20％），不足以判定其為陽性。樣本NBE020、NBE074和NBE077下一代測序結果顯示5.3％、7.4％、5.0％的突變頻率；對應的一代測序峰圖突變堿基峰與背景峰大體一致，判定其為野生型。樣本NBE069下一代測序結果有7.4％的Gly12Cys突變，對應的一代測序峰圖是野生型。

2.2 2種檢測方法相關性分析

以金標準一代測序檢測結果為基礎，驗證下一代測序檢測方法的可行性。通過相應公式計算得到本實驗靈敏度為100％，特異性為91.5％，陽性預測值為86％，陰性預測值為100％，總符合率為94％。以及采用SPSS 20.0統計分析軟件，計算Kappa為0.881。2種測序結果統計具體見表6。

表4 下一代測序檢測結果Table 4 The results of nextgeneration sequencing

3 討論

作為金標準的一代測序法采用Sanger測序原理，4種熒光染料標記的ddNTP，經過單引物PCR反應，采用毛細管電泳技術，實現目的片段的所有堿基序列的檢測。以準確、可靠、檢測范圍廣等為特點，同時具有耗時長、成本高，操作復雜、易污染、靈敏度低等局限性［6］。主要針對已知突變基因的位點設計引物，所以要明確知道該基因位點的具體信息，對于沒有明確的基因位點難以實現測序反應。一代測序的目的在于尋找與疾病相關的特定基因突變，若沒有明確突變基因或篩查數量眾多的基因則難以完成［7］。本研究采用下一代測序技術，經過Ion Proton半導體測序儀能夠檢測出目的片段的堿基序列。該系統采用天然核苷酸和聚合酶、無需激發光源、熒光標記、焦磷酸酶化學級聯以及照相系統直接實時檢測測序時產生的氫離子濃度，有效提高堿基判讀準確性［8］。測序反應開始5m in內即開始得到測序數據，單次運行耗時2 h，測序芯片反應微孔大于1.6億，產出數據量可達10G。相比一代測序具有檢測快速，通量高，能同時檢測出多種不同的突變型別等優勢［9］。

表5 下一代測序檢測結果Table 5 The resultsof nextgeneration sequencing

表6 測序結果比較Table 6 The comparision of sequencing results

本研究對108例結直腸癌臨床樣本KRAS基因檢測結果顯示，一代測序結果有37例陽性（突變率34.3％），下一代測序結果有43例陽性（突變率39.8％），2種方法符合率為94％。與國內外相關報告相符合。37例一代測序陽性樣本在下一代測序結果中顯示較高的突變頻率，此外下一代測序還

檢測出6例突變頻率比較低的樣本（突變頻率＞5％，結果可信）。對應的6例一代測序峰圖由于突變堿基熒光信號弱（靈敏度＜20％）或者突變堿基峰與背景峰大體一致，判定其為野生型。一代測序結果的準確性受測序儀器和設定條件的影響，背景峰的高低也會影響判定結果。腫瘤異質性較明顯時，一代測序的峰圖易受干擾，不能準確判斷突變類型，因此其靈敏度低［10］。下一代測序靈敏度高達100％，特異性為91.5％，陽性預測值86％，陰性預測值100％以及Kappa值＞0.75，驗證下一代測序結果與一代測序有很好的一致性。但2種檢測方法均未檢測到第61密碼子上的突變，可能是由于樣本量少、癌組織處理以及這些突變較少見。因此需要擴大樣本量進行深入研究加以驗證。

目前下一代測序技術廣泛應用于腫瘤基礎科研中，鑒定腫瘤驅動基因突變，發現新的突變基因和位點，并應用于新的藥物靶點和生物標志物的研發。在國外，下一代測序技術在臨床診斷領域得到一定的發展。根據相關腫瘤基因組的信息預測藥物的療效，制訂個體化診療方案，并為新藥的臨床試驗篩選合適的患者［11］。本研究的下一代測序系統具有高通量特點，一張芯片可以同時檢測1～96例樣本；并能檢測出一代測序無法檢測的低頻率突變位點，更好的滿足結直腸癌臨床分子診斷上的需求［12］。

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Based on the next generation sequencing platform for detection colorectal KRAS gene

LILijuan1，LUOWanshan1,ZHANG Jiabin1,WANGQing1,WU Yingsong2★
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.School of Laboratory Medicine Biotechnology，Southern MedicalUniversity，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Objective Based on next generation sequencing technology,to detect and analyze of KRAS genemutations in colorectal cancer,and to assess the feasibility of its application in clinicalmolecular diagnosis.Methods KRAS genemutation was detected in paraffin embedded tissue samples from 108 cases of colorectal cancer by Ion Proton sem iconductor sequencer.The resultswere compared w ith the results from Sanger sequencing which is the gold standard.Results The results of the next generation sequencing were consistent w ith the results of gold standard,w ith the accuracy rate of 94％and sensitivity up to 100％. Conclusion Through the detection and analysis of 108 cases of clinical samples,this next generation sequencingmethod isvalid fordetection of KRAS genemutation in colorectalcancer.

Nextgeneration sequencing;Colorectal cancer;KRAS

廣東省科技計劃項目應用型專項資金（2015B020233009）

1.廣州市達瑞生物技術股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail:wg@smu.edu.cn