藍莓組織RNA提取方法的研究*

余柯達，葉美娟，陳文榮，朱凱麗，張常晶，郭衛東

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

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藍莓組織RNA提取方法的研究*

余柯達，葉美娟，陳文榮，朱凱麗，張常晶，郭衛東

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

為建立藍莓組織RNA提取方法，以藍莓幼果為材料，比較了5種RNA提取方法，建立了改良的十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀(CTAB-KAc)提取方法，并比較了CTAB-KAc法對藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實組織RNA的提取效果．結果表明：CTAB-KAc法提取RNA的過程只需3 h，藍莓幼果RNA的A260/A280和A260/A230值分別達到2.02和2.46，且無基因組DNA污染，RNA產量達到143.37 μg·g-1；用CTAB-KAc法成功提取了藍莓成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實組織的RNA，但是根的RNA提取方法還需優化.把上述RNA反轉錄成cDNA后進行PCR，擴增出預期大小的目的片段，可滿足后續分子生物學實驗的要求．

藍莓；RNA提??；十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀法；多糖；逆轉錄PCR

高質量RNA的提取是進行藍莓轉錄組、基因芯片及Northern分析等分子生物學研究的關鍵前提．由于多年生木本植物含有較多的多糖和多酚、單寧等次生代謝物，其中:多酚會與蛋白質和核酸形成高分子量復合物，減少總RNA的得率[1-3];在醇沉步驟中,多糖會與RNA共沉淀干擾后續的逆轉錄等反應[3-4].因此,一些常見的RNA提取方法(如Trizol法與十二烷基硫酸鈉(SDS)法)和用于提取植物RNA的試劑盒提取的總RNA的含量低且質量差[5-6]．目前,越橘屬的藍莓和黑果越桔主要使用LiCl沉淀RNA以分離多糖和DNA，以得到品質較高的總RNA[6-8].但是,LiCl沉淀RNA需要過夜，極其耗時，且不能沉淀小分子RNA，殘留的Li+還會抑制RNA的反轉錄．在提取云杉[9]和酸模[10]等核酸時用醋酸鹽可有效去除多糖.Lewinsohn等[11]認為在提取裸子植物RNA時在上清液中加入低濃度的乙醇可有效沉淀多糖；而在提取芒果[12]、鐵皮石斛[13]、云杉和白楊[14]RNA時醋酸鹽和乙醇結合使用效果更佳．

本研究以藍莓幼果為實驗材料，綜合比較了5種不同的RNA提取方法，并用其中效果最佳的十六烷基三甲基溴化銨-乙酸鉀(CTAB-KAc)法提取了藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實中的RNA，逆轉錄成cDNA進行PCR，以期為藍莓不同組織RNA的提取提供有效方法，并為其他木本植物RNA的提取提供借鑒．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藍莓樣品于2013年3-6月在浙江師范大學試驗基地3年生藍莓“比洛克西”上取樣，田間采集后立即放入冰盒，回實驗室后用液氮速凍，置-80 ℃超低溫冰箱中備用．本研究以藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實為實驗材料．

本研究所有試劑和離心管等耗材經0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理24 h，滅菌烘干后使用；研缽、藥匙等經180 ℃烘烤6 h．

1.2 RNA提取方法

1.2.1 CTAB-KAc法

取藍莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉移至65 ℃預熱的2 mL離心管(含有0.9 mL CTAB提取液：20 g/L CTAB，20 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl+30 μLβ-巰基乙醇)中，用渦旋震蕩儀震蕩均勻,于65 ℃水浴中加熱10 min，期間顛倒混勻3次；水浴后7 000 r/min離心5 min；取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)，混勻后冰浴30 min，再加入700 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入500 μL水飽和酚溶液(pH 5.2),混勻后再加入500 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃下12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的V氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，渦旋混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min；取上清液，加入等體積的異丙醇,混勻后冰浴沉淀30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀2次，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min,室溫自然干燥10 min，適量DEPC水溶解，-80 ℃保存備用．

1.2.2 CTAB-EtOH法

將“加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”改為“加入1/5體積的無水乙醇”，其他操作按照CTAB-KAc法進行．

1.2.3 CTAB-KAc-EtOH法

將“加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”改為“加入1/5體積的無水乙醇和1/10體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”，其他操作按照CTAB-KAc法進行．

1.2.4 SDS-KAc法

取藍莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉移至65 ℃預熱的2 mL離心管中(含有0.9 mL SDS提取液：5 g/L SDS，20 g/L PVP，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl+30 μLβ-巰基乙醇)，用渦旋震蕩儀震蕩均勻，室溫放置5 min,然后7 000 r/min離心5 min；其他操作按照CTAB-KAc法,從“取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)”這步開始進行．

1.2.5 Trizol-KAc法

根據Life Technologies公司提供的操作說明進行并適當改良:取藍莓幼果材料0.1～0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉移至含有1 mL Trizol試劑的2 mL離心管中，充分混勻，室溫放置5 min；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入1/3體積的5 mol/L KAc溶液(pH 4.8)，混勻后冰浴30 min，再加入500 μLV氯仿∶V異戊醇=24∶1混合試劑，劇烈混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻后室溫放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；去上清，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀2次，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，自然干燥10 min，適量DEPC水溶解，-80 ℃保存備用．

1.3 CTAB-KAc法提取藍莓不同組織的RNA

用CTAB-KAc法提取藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實6種不同器官的RNA．

1.4 測定方法

用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測藍莓總RNA的完整度.RNA的含量和純度采用NanoDrop2000C測定，記錄其濃度、A260/A280和A260/A230的值．

1.5 RT-PCR檢測

以藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實6種不同器官的RNA為模板，按TaKaRa公司PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit操作手冊進行cDNA的合成．以上述6種cDNA和藍莓幼果RNA為模板，并用ddH2O為陰性對照．根據藍莓過氧化氫酶(CAT)基因序列設計PCR檢測所需引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，上游引物CAT-F：5′-ATGGTGGTTGTTGTGATG-3′，下游引物CAT-R：5′-TGATTTCCTTCGTGCC-3′．PCR反應程序為：94 ℃變性4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增30個循環；最后72 ℃保溫10 min．擴增結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測．

2 結果與分析

2.1 5種方法提取藍莓果實RNA的比較

5種方法對藍莓幼果RNA的提取在耗時方面均為3 h以內．除Trizol-KAc法外，其他4種方法從藍莓果實中提取的總RNA在異丙醇沉淀離心后為白色沉淀，干燥后為無色沉淀；而Trizol-KAc法在異丙醇沉淀離心后為無色膠狀沉淀．電泳結果(見圖1)表明：CTAB-KAc法、CTAB-EtOH法、CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法均能看到藍莓果實RNA的28S，18S和5S rRNA條帶，而Trizol-KAc法幾乎看不到rRNA條帶；CTAB-EtOH法、CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法所提RNA中還存在基因組DNA污染，尤其以CTAB-KAc-EtOH法和SDS-KAc法所提RNA中基因組DNA含量最高；RNA含量和質量方面，以CTAB-KAc法和SDS- KAc法為最佳，尤其是CTAB-KAc法提取的RNA的28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA條帶的2倍，表明所提RNA無降解且較完整．

1：Trizol-KAc法；2：SDS-KAc法；3：CTAB-EtOH法；4：CTAB -KAc-EtOH法；5：CTAB-KAc法圖1 5種提取方法所得RNA的電泳圖

用NanoDrop2000C測定5種提取方法所得RNA的產量、A260/A280和A260/A230，結果見表1．Trizol-KAc法無法從藍莓果實中提取出RNA．其他4種方法在RNA產量方面,以CTAB-KAc法和SDS-KAc法最高，均在100 μg·g-1以上．4種方法的A260/A280均為1.90～2.10，A260/A230都在2.0以上，表明無蛋白質、酚類和多糖等污染．結合電泳結果(見圖1)進行綜合分析，提取藍莓果實RNA以CTAB-KAc法為最佳．

表1 5種提取方法所得RNA的產量和質量

2.2 CTAB-KAc法對不同藍莓組織RNA的提取

用CTAB-KAc法提取了不同藍莓組織的RNA.由表2可知：CTAB-KAc法在提取藍莓成熟葉、綠莖和幼果組織RNA時，RNA產量達到100 μg·g-1以上，花的RNA產量也在80 μg·g-1以上，且A260/A280為2.00～2.10，A260/A230都在2.30以上，說明無蛋白質、酚類和多糖等污染；成熟果的RNA產量僅為18.95 μg·g-1，A260/A280為1.98，A260/A230僅為1.64，可能所得RNA含有多糖等雜質；根的RNA產量最低，只有9.36 μg·g-1，且A260/A280和A260/A230僅為1.77和1.44，A260/A280為1.70～2.00，在cDNA合成的可用范圍內，但A260/A230過低，說明存在大量的蛋白質、酚類和多糖等雜質．電泳結果(見圖2)也與上述結論一致．

表2 CTAB-KAc法提取藍莓不同組織中RNA的產量和質量

1：成熟果實；2：幼果；3：花；4：成熟葉；5：綠莖；6：根
圖2 CTAB-KAc法提取各藍莓組織RNA的電泳圖

2.3 RT-PCR分析

以CTAB-KAc法提取的6種不同藍莓組織RNA反轉錄成的cDNA、藍莓幼果RNA和ddH2O為模板，用藍莓CAT基因特異引物CAT-F和CAT-R進行PCR，幼果RNA和ddH2O為模板的對照中沒有擴增出條帶，6種不同藍莓組織的cDNA中，成熟葉、綠莖、花、幼果和成熟果擴增出了預期的約850 bp的CAT基因片段，根沒有擴增出任何條帶(見圖3)．由此進一步說明CTAB-KAc法對藍莓葉、莖、花和不同成熟度果實提取的RNA質量較好，且不存在基因組DNA污染，可以直接用于后續研究，但對根的RNA提取有難度．

1:幼果RNA；2:ddH2O；3:成熟果cDNA；4:幼果cDNA；5:花cDNA；6:成熟葉cDNA；7:綠莖cDNA；8:根cDNA；M:Marker 2000
圖3 不同藍莓組織RT-PCR產物的電泳圖

綜上所述，本實驗的5種RNA提取方法中，以CTAB-KAc法為最佳．本實驗室目前已將CTAB-KAc法成功地應用于番茄、煙草、佛手和香櫞的葉片、花瓣、雌蕊、雄蕊及櫻桃花芽的RNA提取，用該方法提取的各種植物的RNA樣品可用于RT-PCR和熒光定量PCR(結果未列)．

3 討 論

完整性好、純度高的RNA是進行分子生物學研究的基礎．本實驗采用5種方法提取藍莓幼果RNA，通過比較發現，將以CTAB為主要成分的RNA提取液和多糖沉淀試劑KAc結合的CTAB-KAc法是提取藍莓幼果RNA的最佳方案．多糖是影響藍莓RNA提取的主要干擾因素.多糖的許多理化性質與RNA極其相似，用一般方法很難將它們分開，去除多糖的同時RNA也會被部分帶走，造成RNA產量降低[15];且RNA中殘余的多糖還會抑制后續基因操作過程中的多種酶反應[16]．本實驗分別對KAc，EtOH和KAc-EtOH進行了比較，以探求最佳的藍莓多糖去除試劑．結果顯示：3種試劑獲得RNA的A260/A230值相近，表明在多糖去除能力上3種試劑效果相近；但利用EtOH和KAc-EtOH得到的RNA產量遠低于KAc(見表1)，且EtOH和KAc-EtOH去除多糖后獲得的RNA中存在基因組DNA污染(見圖1).因此，KAc去除多糖的效果優于EtOH和KAc-EtOH．本實驗還分別對CTAB提取液、SDS提取液和Trizol試劑進行了比較，以尋求最佳的RNA提取液．Trizol試劑無法從藍莓幼果中提出RNA，可能與Trizol試劑所含的酚和異硫腈酸胍等組分的緩沖能力較差有關[17-18].CTAB提取液比SDS提取液在RNA產量上略優，且不存在基因組DNA污染.因此，CTAB提取液是提取藍莓RNA的最佳提取液.其他植物RNA提取多以SDS等試劑與KAc，EtOH或KAc-EtOH組合的方法所得RNA質量較好[9-14]，說明不同植物材料RNA提取的干擾因素不同，使用的RNA提取方法也可能不同[19]．

本實驗從5種方法中篩選出藍莓RNA提取的最佳方法——CTAB-KAc法，并用該方法對藍莓根、成熟葉、幼莖、花、幼果和成熟果實的RNA進行了提取，其中：對成熟葉、綠莖、花和幼果組織RNA的提取效果最佳，而成熟果RNA的A260/A280為1.98，A260/A230僅為1.64，可能有多糖等雜質污染，5種藍莓組織的RNA可用于RT-PCR及其他后續研究；對根RNA的提取效果最差，不能用于后續實驗．表明CTAB-KAc法并不適于所有藍莓組織RNA的提取.這與Ainsworth[10]的觀點一致,即：同一種植物不同組織的RNA提取方法會有很大的差異，主要原因是不同組織中的主要干擾物不同，對其高質量RNA的提取方法需進一步優化．孫瑩等[6]和Vashisth等[8]用LiCl沉淀RNA的方法對藍莓幼果提取得到的總RNA產量約為25 μg·g-1，而本實驗CTAB-KAc法的RNA產量比之高出約110 μg·g-1，在成熟葉、幼莖和成熟果的RNA產量上也比文獻[8]略高或相近．

藍莓等多年生木本植物在分子生物學方面的研究目前仍處于起步階段，且尚無高效的RNA提取方法的報道．使用目前較通用的LiCl法對木本植物材料進行RNA提取，不僅實驗周期長達20 h，且會造成小分子RNA的丟失[6,8]．本研究建立的CTAB-KAc法只需0.1～0.2 g實驗材料，用時3 h，且可同時對多個樣品進行RNA提??；此外，CTAB-KAc法中用異丙醇沉淀RNA，預計還可以用于小分子RNA的提?。瓹TAB-KAc法適用于藍莓葉、幼莖、花、果實等各種組織RNA的提取，可為深入進行藍莓分子生物學研究奠定基礎．

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(責任編輯 薛 榮)

Methods for RNA isolation from blueberry tissues

YU Keda,YE Meijuan,CHEN Wenrong,ZHU Kaili,ZHANG Changjing,GUO Weidong

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

Tissues of blueberry were generally rich in polysaccharides,proteins,and polyphenols,resulting in the difficulties of RNA isolation with both high quantity and quality.To optimize the technology of RNA isolation from blueberry tissues,five methods for RNA extraction from immature fruit of blueberry were evaluated.The results showed that the most efficient technique for RNA isolation from blueberry fruits was the optimized CTAB-KAc-based method.A subsequent experiment showed that the optimized CTAB-KAc-based technique was also efficient in successful RNA isolation from full-expanded leaf,green stem,flower,immature fruit and mature fruit of blueberry,although protocol for roots still needed to be optimized.The method yielded 143.37 μg·g-1high-quality RNA without DNA contamination within 3 h.The ratios ofA260/A280andA260/A230of the total RNA from immature fruit of blueberry were 2.02 and 2.46,respectively.Reverse transcription-PCR confirmed that the isolated RNA was of appropriate quality and integrity for subsequent molecular biology studies.

blueberry; RNA isolation; CTAB-KAc method; polysaccharides; RT-PCR

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.01.011

??2015-03-19；

2015-04-09

浙江省科技計劃公益技術研究項目(2013C32074)；浙江省重大科技專項(2013C02004)

余柯達(1990-)，男，浙江余姚人，碩士研究生.研究方向:分子生物學.通信作者：郭衛東.E-mail:gwd@zjnu.cn

S663.9

A

1001-5051(2016)01-060-05