11個苜蓿品種種子寄藏真菌檢測與鑒定

先米西努爾·肉孜，李克梅，阿提開姆·如則，古麗巴哈爾·熱合買提

(新疆農業大學農學院/新疆農林有害生物監測與防控重點實驗室，烏魯木齊 830052)

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11個苜蓿品種種子寄藏真菌檢測與鑒定

先米西努爾·肉孜，李克梅，阿提開姆·如則，古麗巴哈爾·熱合買提

(新疆農業大學農學院/新疆農林有害生物監測與防控重點實驗室，烏魯木齊 830052)

【目的】分離和鑒定不同產地的苜蓿種子寄藏真菌，明確其寄藏真菌種類和帶菌率，為苜蓿的引進、抗病育種及生產中苜蓿病害綜合防治提供理論依據。【方法】采用平皿測定方法，分別對來自國內外不同區域的11個苜蓿品種，進行種子寄藏真菌分離、純化和鑒定。【結果】共檢測到種子寄藏真菌13屬16種。其中來自國外的阿爾岡金、4030、金皇后、巨能2號、超音速等品種帶菌率較高。黑曲霉(Aspergillusniger)、細交鏈孢(Alternariaalternata)是優勢種群。【結論】苜蓿種子攜帶真菌現象極為普遍，經消毒處理的種子帶菌率顯著降低，且經過表面消毒處理的種子，與未進行表面消毒種子檢出寄藏真菌種類存在顯著差異。

苜蓿；種子；寄藏真菌；種類

0 引 言

【研究意義】苜蓿是世界上最重要的、栽培最早、分布面積最大的多年生優質豆科牧草，因其營養價值高、適口性好，素有“牧草之王”的美譽[1]。隨著我國苜蓿栽培面積的不斷擴大，尤其是苜蓿在我國西部開發、退耕還草、種草養畜、改善生態環境等方面的重大作用，苜蓿必將成為我國種植結構調整的切入點和農村經濟發展新的增長點[2]。 種子作為高等植物的繁殖器官可攜帶大量危害種苗或植株的真菌、細菌、病毒等微生物和線蟲[3]，它既是病害的載體又是受害者。在這些微生物中，真菌對種子的質量影響最大[4-6]。種子品質是提高作物產量和質量的重要物質基礎。對種子進行帶菌檢測是保證種子質量的重要內容之一[7]。近年來隨著種子市場的開放，種子貿易量的迅速增長，帶菌種子已成為病害跨地區傳播流行的重要原因，因此對種子進行健康檢測是保證種子質量，及控制種傳病害最方便有效的方法，可有效地防治病害的發生，因此，對苜蓿種子進行帶菌檢測和種子處理是生產上減低種子帶菌率、有效控制種子病原菌擴大傳播、培育壯苗、增加草場建植持久性的重要措施，對建立苜蓿病害綜合防治體系，將危害降到最低限度，促進苜蓿產業的可持續發展和生態環境建設有重大意義。【前人研究進展】研究表明，種子帶菌是普遍現象，李春杰等[8]曾對國內38個苜蓿種子樣品進行了系統的種帶真菌檢測研究，參試種樣不經過表面消毒測定出21種25個真菌分離物， 李克梅等[9]用吸水紙檢驗法，對新疆苜蓿品種種子及植物組織殘體上進行種帶真菌檢測，總共測定了21種真菌，種子分為經過表面消毒(0.1%升汞消毒)只檢測到7種真菌，而不經表面消毒苜蓿種子檢測到13種真菌。陳燾等[10]對來自青海的5個不同收獲年份的老芒麥種樣進行種帶真菌研究(NaClO消毒處理)測定了12種種帶真菌。【本研究切入點】近年來，隨著國外作物種子的大量引進，傳入新疆的植物病害種類逐漸增多。由于苜蓿品種和產地不同，消毒方法不同，檢測方法也有差異，故常造成帶菌種類檢測結果的差異。分離鑒定苜蓿種子寄藏真菌，明確苜蓿種子寄藏真菌檢測的適宜方法。【擬解決的關鍵問題】研究針對來自美國、加拿大、澳大利亞、中國新疆、黑龍江、寧夏、甘肅等11個來自國內外不同區域的苜蓿種樣，進行種子表面不消毒和消毒處理，分別檢測寄藏真菌種類鑒定。比較兩種處理方式對種子寄藏真菌種類檢測結果的影響，為選擇合適的種子寄藏真菌檢測方法提供依據。同時，確定引進的苜蓿種子帶菌情況，可為種子生產、儲藏加工、包衣劑的設計、種子消毒方式的選擇，及對控制苜蓿種傳病害的發生、危害及采取有效防治措施提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試11份苜蓿種樣分別來自美國、加拿大、澳大利亞，中國新疆、黑龍江、寧夏、甘肅。表1

表1 苜蓿種樣來源

1.2 方 法

1.2.1 種子寄藏真菌的檢測

1.2.1.1 未處理種子寄藏真菌檢測

將供試的不同苜蓿品種不經表面消毒分別隨機選取10粒種子均勻擺放于含有100 mg/L氯霉素的9 cm直徑PDA平板上，5皿為一個重復，共設4個重復，置25℃恒溫黑暗培養。第3 d挑取不同顏色、形狀的菌絲進行純化培養，第7 d時鏡檢記錄每粒種子上分離出真菌種類及分離頻率。

1.2.1.2 表面消毒種子寄藏真菌檢測

采用李春杰的方法[8]，稍有改動。每個品種隨機選取200粒種子， 1%NaClO溶液浸泡消毒10 min，無菌蒸餾水充分洗滌5次，用滅菌濾紙吸干種子表面的水分[11]。用經火焰灼燒滅菌的鑷子隨機選取10粒種子，等距離置于含有100 mg/L氯霉素的9 cm 直徑PDA平板上，每皿10粒，5皿為一重復，共設4個重復，25℃ 恒溫黑暗培養。第7 d時記錄每粒種子上分離出真菌種類、檢出率。

計算公式如下：

帶菌率(%)=(帶菌種子總數/檢測種子總數)×100。

某菌檢出率(%)=(帶某類菌種子數/帶菌種子總數)×100。

1.2.2 種子寄藏真菌的鑒定

將從種子分離得到的真菌做標記并分別進行純化、轉管保存和鏡檢。根據真菌培養性狀和顯微形態特征，依據Barnett H.L.和Hunter B.B.(沈崇堯譯)《半知菌屬圖解》[12]、張中義《植物病原真菌學》[13]、邵力平等《真菌分類學》[14]等資料的描述將其鑒定到種，個別真菌鑒定到屬。

2 結果與分析

2.1 未處理種子寄藏真菌檢測

未處理種子帶菌率為13.5%～87.5% ，平均為36.9% 。不同種樣帶菌率差異顯著(P<0.05)，其中來自加拿大的3份種樣帶菌率均較高，阿爾岡金帶菌率高達87.5%，4030、金皇后帶菌率分別為60%和51.5%；美國的巨能2號、澳大利亞的超音速種子帶菌率分別為45.5%和40%，上述種樣帶菌率均顯著高于6個國內種樣。表2

供試11個未經處理的苜蓿種子檢出寄藏真菌9屬12種真菌。分別為4種曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黃曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、雜色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)、細交鏈孢(Alternariaalternata)、鐮刀菌(Fusariumsp)。

未處理種子中各種真菌的分離頻率為0%～75.5%，檢出率最高的是黑曲霉(Aspergillus niger)，高達75.5%，最低的是高大毛殼(Chaetomiumelatum)，僅2.3%。其中11個種子樣品中檢出黑曲霉，8個樣品中檢出意大利青霉，6個樣品中檢出黃曲霉、細交鏈孢，5個樣品中檢出鐮刀菌。表3

2.2 表面消毒種子寄藏真菌檢測

經表面消毒處理種子寄藏真菌帶菌率為3.5%～46.5% ，平均為19.6% 。其中來自加拿大的阿爾岡金、4030、美國的巨能2號帶菌率分別是46.5%、36%、28.5%，高于其他種樣。表2

經表面消毒處理的種子中分離鑒定出9屬12種真菌。分別為4種曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黃曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、雜色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、細交鏈孢(Alternariaalternata.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)。與未經處理種子檢測到的寄藏真菌相比，枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp.)4種菌在經處理的種子上檢測到，而未經處理種子中檢測到的桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)4種菌在種子表面消毒處理后未檢測到。表3

各種真菌的分離頻率為1.1%～75%。分離頻率最高的是細交鏈孢(Alternariaalternata，75%)最低的是聚多曲霉(Aspergillussydowii，1.1%)。較未經處理的種子，各種真菌經消毒處理帶菌率顯著降低，且各種真菌的檢出率則有差異。

表2 苜蓿種子寄藏真菌帶菌率(%)

注：同列不同小寫字母表示差異達(P<0.05)顯著水平

Note：Different lowercase letter in same line means the test differences are significant (P<0.05)

表3 苜蓿種帶真菌種類及檢出率

3 討 論

研究顯示，未經表面消毒處理的種子帶菌率為13.5%～87.5% ，平均為36.9%，而經消毒處理的種子帶菌率為3.5%～46.5% ，平均為19.6%，種子消毒前后的帶菌率存在顯著差異，說明表面消毒處理可顯著減少種子寄藏真菌的帶菌率。

11份苜蓿種樣共檢測到13屬16種真菌，但其中枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp.)4種菌在未經處理的種子上未檢測到，推測這幾種菌可能需要較多的水分才能生長，因未處理的種子是干種子而未能很好的萌發生長；桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)4種菌在種子表面消毒處理后未檢測到，推測該類菌對表面消毒劑次氯酸鈉敏感而被殺死故沒有長出。目前針對種子寄藏真菌帶菌檢測，常用的方法是種子不經處理直接培養檢驗[7,8]，但這一結果說明，可能直接培養干種子進行帶菌檢測，可能會使一些對濕度要求高的真菌檢測不出來，因而造成漏檢的現象，這是在種子寄藏真菌檢測中值得注意的問題。

苜蓿不同產地各種樣之間以及同產地不同品種之間種子帶菌率均存在較大的差異，來自加拿大、美國、澳大利亞的苜蓿種子帶菌率相對于國內種子帶菌率偏高，而新疆、寧夏、甘肅等干旱地區種子帶菌率則較低。南志標[15]報道沙打旺種子成熟和收打期間產地的濕潤度與種子帶菌率呈正相關，故外國種子帶菌率偏高可能與當地降水較豐富有關。

被檢測的國外種子在收集、儲存、轉運過程中程序多，流程長，更容易沾染和滋生真菌，故建議在加強國外苜蓿種子的帶菌檢測，尤其是加強一些高危、檢疫性的病害的檢測，如，苜蓿黃萎病Verticilliumalbo-atrumReinke & Rerthold的檢測，或者直接引進經過包衣處理的種子。

有報道認為，對某些作物種子帶菌檢測的研究發現，表面消毒是必須的[16]，否則根霉等生長迅速的真菌會對生長相對緩慢的植物病原真菌產生抑制作用[17]。但亦有研究表明表面消毒會減少檢出的真菌種數和降低檢出率[18]。研究結果顯示，苜蓿種子檢測前是否經表面消毒，對真菌檢出種數與檢出率有顯著影響。選擇合適的表面消毒劑是植物無菌操作的重要步驟，提高消毒效果、減輕對植物傷害以及價格低廉是選擇表面消毒劑的原則[19]。研究表明，2% NaClO溶液即可起到種子表面消毒的效果，又不影響種子的發芽率，是一種安全、適用的表面消毒處理劑。

種子寄藏真菌并不都是致病菌，對從苜蓿種子分離到的真菌開展其致病性測定研究，進一步區分致病菌和腐生菌，評價各種寄藏真菌對苜蓿種子發芽和出苗的影響，并對致病菌開展種子處理研究，最終達到防止病害傳播和減輕苗期病害的目的。

4 結 論

供試11份苜蓿種子共檢出寄藏真菌13屬16種。分別為4種曲霉(Aspergillusniger、Aspergillus.flavus、Aspergillus.sydowii、Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)、細交鏈孢(Alternariaalternata.)、鐮刀菌(Fusariumsp)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp)。其中來自國外的阿爾岡金、4030、金皇后、巨能2號、超音速等品種帶菌率較高。是否經過表面消毒處理的種子病菌檢出種類有差異，可能與病菌的帶菌部位和病菌萌發生長需要的濕度條件不同有關。

References)

[1] 郭玉霞.不同生態區苜蓿根部入侵真菌研究[D] 鄭州: 河南農業大學博士論文，2010.

GUO Yu-xia.(2010).Root-invadingFungiofAlfalfaandTheirPathogenicityinDifferentEcologicAreas[D]. PhD Dissertation. Henan Agricultural University，Zhengzhou. (in Chinese)

[2] 戚志強，玉永雄，胡躍高，等.當前我國苜蓿產業發展的形勢與任務[J].草業學報2008，17(1)：107-113.

QI Zhi-qiang，YU Yong-xiong，HU Yue-gao，et al. (2008). Current Situation and Tasks of Industrial Development Alfalfa of our Country [J].ActaPrataculturaeSinica，17(1)：107-113. (in Chinese)

[3] Sinclair, J. B. (1979). The seed: a microcosm of microbes.JournalofSeedTechnology, 4(2):68-73.

[4] Mirocha, C. J., Pathre, S. V., Schauerhamer, B., & Christensen, C. M. (1976). Natural occurrence of fusarium toxins in feedstuff.Applied&EnvironmentalMicrobiology, 32(4):553-556.

[5] Dennis C. (1977). Susceptibility of stored crops to microbial infection.AnnalsofAppliedBiology.

[6] Chauohary, K. C. B., And, D. K. G., Centre, S., Tadong, & Gangtok. (2012). Seed microflora of vegetable mustard.IidianPhytopathology, 47(4):422-423.

[7] 張國珍，張樹峰.北京和東北地區西洋參種子的帶菌檢測[J].中國中藥志，2002，27(9):658-661.

ZHANG Guo-zhen，ZHANG Shu-feng. (2002). Testing of Seed borne Fungi of American Ginseng Seeds in Erea of Beijing and Dongbei [J].JournalofTraditionalChineseMedicine， 27(9):658-661. (in Chinese)

[8] 李春杰，南志標.苜蓿種帶真菌及其致病性測定[J]. 草業學報，2000，9(1):27-36.

LI Chun-jie，NAN Zhi-biao. (2000). Testing of Seed borne Fungi and Pathogenicity of Alfalfa [J].ActaPrataculturaeSinica， 9(1):27-36. (in Chinese)

[9] 李克梅， 任秀章， 張照紅.新疆苜蓿種帶真菌檢測初報[J]. 石河子大學學報( 自然科學版)，2004，(7):166-167.

LI Ke-mei，REN Xiu-zhang，ZHANG Zhao-hong. (2004). Primary Report of Test for Seed- borne Species of Fungi on Alfalfa in Xinjiang [J].JournalofShiheziUniversity(NaturalScience)， (7):166-167. (in Chinese)

[10]陳燾, 南志標. 不同儲存年限老芒麥種子種帶真菌檢測及致病性測定[J]. 草業學報, 2015,(2): 96-103.

Chen Tao, Nan Zhibiao. Seed-borne fungi infection of siberian wilder: effects on seed germination and seedling growth[J].Journalof Pratacultural Science,2015,(2):96-103.

[11] 徐秀蘭，吳學宏，張國珍，等. 甜玉米種子攜帶真菌與種子活力關系分析[J].中國農業科學，2006，39(8):1 565-1 570.

XU Xiu-lan，WU Xue-hong，ZHANG Guo-zhen，et al. (2006). Seed borne Fungi of Sweet Corn and The Analysis of Seed vigor [J] .ScientiaAgriculturaSinica, 39(8):1,565-1,570. (in Chinese)

[12] Barnett H L， Hunter BB. 半知菌屬圖解[M]. 沈崇堯譯. 北京: 科學出版社，1977.

Barnett, H. L,， Hunter, B.B.. (1977).FungiImperfecti[M]. Translated by SHEN Chong-yao. Beijing: Science Press,. (in Chinese)

[13] 張中義，冷懷瓊，張志銘，等. 植物病原真菌學[M]. 成都:四川科學技術出版社，1998.

ZHANG Zhong-yi，LENG Huai-qiong，ZHANG Zhi-ming，et al. (1998).PlantPathogenicMycology[M]. Chengdu: Sichuan Science and Technology Press. (in Chinese)

[14] 邵力平，沈瑞祥，張素軒，等. 真菌分類學[M]. 北京: 中國林業出版社，1992.

SHAO Li-ping，SHEN Rui-xiang，ZHANG Su-xuan，et al. (1992).FungalTaxonomy[M].Beijing: China Forestry Publishing House. (in Chinese)

[15] 南志標 .沙打旺種帶真菌-環境、致病力及防治 [J].草業學報 , 1998,7(1):12-18.

Nan Zhi-biao. Adsurgens fungi species- environment, pathogenicity and Prevention[J]. Journal of Prataculture , 1998,7(1): 12-18.

[16] Association, I. S. T. (1959). International rules for seed testing. rules 1999.SeedScience&Technology, (4):23-28.

[17] Agarwal, V. K., & Sinclair, J. B. (1988). Principles of seed pathology.CRCPressInc:40-45.

[18] Barbetti, M. J. (1990). Fungi associated with seed of subterranean clover (Trifolium subterraneum) in Western Australia.SeedScience&Technology, 18(3):673-679.

[19] 孫宏 . 能源作物甜高粱培育及能量轉換技術研究 [J]. 農業工程學報，2006，10，22(1):256-258.

SUN Hong. (2006). Technical research on breeding and energy conversion of sweet sorghum [J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering, 22(1):256-258. (in Chinese)

Fund project:Supported by Special funds for Agricultural scientific research in the national public welfare industry (201303057) and Key Laboratory of grassland resources and ecology in the Xinjiang Uygur Autonomous Region (XJDX0209-2012-01)

Detection and Identification of Eleven Kinds of Alfalfa Seed-Borne Fungi

Xianmixinuer Rouzi, LI Ke-mei, Atikaimu Ruzi, Gulibahaer Rehemaiti

(Key Laboratory of Monitoring and Controlling Agricultural and Forestry Pests /CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 The project aims to isolate and identify the borne fungi on alfalfa seeds from different origins in order to provide a theoretical basis for clearing the fungal species, infection rate and the introduction of alfalfa, breeding for integrated control of alfalfa diseases in disease resistance breeding and production.【Method】Seed-borne fungi and disinfection effect of eleven alfalfa species from different origins at home and abroad were determined by means of perti dish testing.【Result】The results showed that 16 fungi species that belonged to 13 genera were carried by rapeseeds. The carrier rate of species from home and abroad was higher.Aspergillusniger,Alternariaalternatawere the main seed-borne pathogens.【Conclusion】Alfalfa seed carrying the fungus is a common phenomenon, the disinfection of seed infection rate was significantly reduced, and there are significant differences between the seeds after disinfection those without disinfection.

alfalfa；seed；borne fungi；species

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.015

2016-02-20

國家公益性行業農業科研專項(201303057)；新疆維吾爾自治區草地資源與生態重點實驗室項目(XJDX0209-2012-01)

先米西努爾·肉孜(1989-),女, 新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向為牧草病害及防治，(E-mail)840300914@qq.com

李克梅(1973-),女，江蘇如皋人，副教授，博士，研究方向為牧草病害，(E-mail) lindali1118@sina.com

S435.4

A

1001-4330(2016)07-1281-07