新疆變色石竹繁殖生物學特性研究

馬際凱，董連新

(新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

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新疆變色石竹繁殖生物學特性研究

馬際凱，董連新

(新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052)

【目的】觀察變色石竹花期動態，分析花粉活力、柱頭可授性的發生規律，為野生石竹種質資源利用及雜交育種提供理論依據?！痉椒ā坑^測記錄變色石竹花期。以變色石竹花粉為材料，采用L9(33)正交設計研究蔗糖、硼酸、氯化鈣對變色石竹花粉離體萌發的影響。運用碘-碘化鉀染色法、TTC染色法、花粉萌發法動態測定花粉活力，采用聯苯胺過氧化氫法測定柱頭可授性。【結果】變色石竹開花在5月中下旬，盛花期從6月延續到9月，花期持續時長為165 d左右；10 g/L蔗糖+0.1 g/L硼酸+0.05 g/L氯化鈣為比較適合變色石竹花粉萌發培養基；花粉在開花第6 h至第6 d花粉都具有活力，開花第2 d花粉活力最高；柱頭從開花第3 d逐漸具有可授性，到第8 d可授性消失?！窘Y論】變色石竹花部圖案多變，花期較長具有一定的觀賞價值。蔗糖、硼酸、氯化鈣均對花粉萌發具有促進作用，TTC染色法測定花粉活力相對便捷準確，開花第4～6 d內柱頭可授性最強。

石竹；培養基；花粉活力；柱頭可授性

0 引 言

【研究意義】石竹(Dianthus)屬植物葉形優美，花團錦簇，花色豐富，一直以來被認為是既可作切花、盆花，又可作花壇植物和地被植物的優良觀賞花卉。目前很多商品石竹經過多次雜交出現雄蕊瓣化，產生花粉少，子房發生畸變的現象，很大程度上影響到育種效率[1]。而野生石竹由于地理隔離避免了雜交后出現的品種退化現象，經過長期的自然選擇野生石竹具備一些栽培品種無法比擬的優勢。因而對野生石竹屬植物開展研究和新種類新品種的開發利用日顯迫切。新疆是我國石竹屬植物的分布中心，新疆的天山山脈和阿爾泰山山脈分布著豐富的野生石竹種質資源[2]。變色石竹(Dianthusversicolor)就是一種廣泛分布于天山山脈，花色多變的野生石竹，除花喉部圖案多變花形優美外，還是名貴的蒙藥材，可以用于調節血壓治療心腦血管疾病[3]，對肺炎、傷寒有一定的療效[4]。研究變色石竹開花生物學特性對于野生石竹雜交育種、資源開發以及種質資源創新具有一定的參考價值?！厩叭搜芯窟M展】有關植物開花生物學特性方面的研究有很多，肖真真等[5]通過運用幾種花粉活力測定法測定核桃花粉活力篩選出最適宜核桃花粉活力測定的方法。孫強[1]研究了地被香石竹花粉形態和生物學特性，為地被香石竹的雜交育種提供了便利依據。前人對野生櫻桃花粉活力與授粉結實特性進行了研究，為野生櫻桃人工栽培和選育給出了理論參考[6]。【本研究切入點】周旭紅等[7]僅對香石竹花粉萌發進行了研究，而對野生石竹開花繁育系統方面的研究還未見報道。研究在前人研究的基礎上，對變色石竹花期進行觀測，篩選出變色石竹花粉最適萌發培養基配方?！緮M解決的關鍵問題】研究比較分析變色石竹花粉活力測定方法，對花粉活力、柱頭可授性進行動態測定，為野生石竹的雜交育種和種質資源創新提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為天山山脈西緣自然分布的變色石竹(Dianthusversicolor)花材，2013年整株引種至新疆農業大學實驗苗圃(N 44°05'48.07''，E87°03'11.23''；海拔848 m)。2014年6月于盛花期選取無病害、蟲害的健壯植株，10:00～11:00采集實驗所需時期的花朵置于冰盒中備用至實驗[8]。表1

表1 變色石竹引種來源

1.2 方 法

1.2.1 花期觀察與記錄

根據Dafni花期觀察標準[9]：全柱約有5%的花蕾出現為現蕾期；25%花朵開放為初花期；50%花朵開放為盛花期；50%花朵脫落為落花期。從花蕾期開始到末花期觀察變色石竹開花動態，記錄連續花期。

1.2.2 花粉活力測定

1.2.2.1 花粉離體萌發

正交試驗設計：液體培養基主要成分為蔗糖、硼酸、氯化鈣。采用L9(33)正交試驗設計，研究培養基中蔗糖(A)、硼酸(B)、氯化鈣(C)，3個因素對變色石竹花粉離體萌發的影響。每個處理做3個玻片重復，每片選取3個視野，選取視野花粉總數不少于50個，統計花粉萌發率。表2

花粉活力測定采用液體培養法[10]，將開花第6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的花藥置于凹玻片中央，用鑷子碾碎使花粉粒充分釋放，加2～3滴正交試驗中選出的最佳培養基，于35℃人工氣候箱中培養4 h，取出在顯微鏡下觀察。

萌發率=(已萌發花粉數/觀測花粉總數)×100%.

表2 不同培養基對變色石竹花粉離體萌發影響的正交設計

1.2.2.2 碘-碘化鉀染色法

采用碘-碘化鉀染色法測定花粉活力[11]，將開花第6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的花藥置于載玻片中央，滴1～2滴蒸餾水，用鑷子碾碎使花粉粒充分釋放，加1～2滴1%碘-碘化鉀染色液于25℃恒人工氣候箱染色20 min后于顯微鏡下觀察花粉染色情況并計數。每個時期花粉做3個片，每片選取3個視野，選取視野花粉總數不少于50個，具活力的花粉呈藍色，統計染色比率。

花粉活力比率=(染色花粉數/花粉總數)×100%.

1.2.2.3 TTC染色法

采用TTC染色法測定花粉活力[12]，將開花第6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d的花藥置于載玻片中央，用鑷子碾碎使花粉粒充分釋放，加1～2滴0.5%TTC染色液，在35℃人工氣候箱中染色30 min于顯微鏡下觀察。每個時期花粉做3個片，每片選取3個視野，選取視野花粉總數不少于50個，具活力的花粉呈紅色，統計染色比率。

花粉活力比率=(染色花粉數/花粉總數)×100%.

1.2.3 柱頭形態觀察及可授性測定

1.2.3.1 柱頭形態

用鑷子將花瓣剝離使柱頭完全露出，觀察柱頭長度、顏色、柱頭彎曲程度以及柱頭絨毛發育情況[13]。

1.2.3.2 柱頭可授性

采用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[14]，溶液配制：稱取1 g過氧化氫溶于100 mL蒸餾水中，將30%過氧化氫稀釋到3%，按照聯苯胺∶過氧化氫∶水=4∶11∶22的比例配置好反應液?？墒谛杂^察：將開花第1、2、3、4、5、6、7、8、9 d的柱頭剝離出的柱頭置于凹玻片中央，加入聯苯胺-過氧化氫反應液后直接置于顯微鏡下觀察。根據產生氣泡量判斷柱頭可授性強弱。

1.3 數據統計

試驗數據采用Excel 2003及SPSS 17.0分析處理，花粉萌發率數據若不符合方差齊性要求則經過平方根反正弦轉換后再進行分析。

2 結果與分析

2.1 變色石竹花期

變色石竹花期從花蕾期到末花期持續時間共162 d左右，花蕾期在5月中下旬，6月初花蕾量逐漸增多并開放達到初花期；6月初直到10月中上旬為盛花期此時開花量最大，在7月底開花量達到峰值；從10月下旬開始開花量減少直至11月初不再開花。表3

表3 變色石竹花期(月·日)

2.2 各因素質量濃度對變色石竹花粉萌發的影響

研究表明，參試組平均花粉萌發率分別為：4.32%、5.15%、5.36%、23.62%、48.60%、32.85%、25.76%、29.57%、26.61%，花粉萌發率最高的為A2B2C3培養基，萌發率達到48.60%。A1B3C1、A1B1C1培養基萌發率較低，花粉萌發不均勻。根據多重比較發現，蔗糖三個水平間相互差異顯著，A2水平下萌發率最高。硼酸B1和B3水平間沒有顯著差異，而B2與B1、B3差異顯著。氯化鈣C1與C2、C3間差異不顯著，而C2與C3間具有顯著差異，在C3水平下萌發率較高。多重比較結果得出，花粉萌發培養基最佳組合為A2B2C3。表4

研究表明，蔗糖濃度對花粉萌發的影響極顯著，硼酸濃度對花粉萌發影響極顯著，氯化鈣濃度對花粉萌發有顯著性影響。適宜濃度的蔗糖對于變色石竹花粉萌發具有明顯促進的作用，適宜濃度的硼酸對花粉萌發的作用很明顯，氯化鈣對變色石竹花粉萌發有一定的促進作用。表5

2.3 花粉染色及花粉壽命

對于變色石竹，從開始散粉到散粉第2 d花粉活力呈上升趨勢，第3至第6 d花粉活力總體呈下降趨勢直到第6 d花粉不具活力。研究表明，開花后6 h變色石竹開始散粉，此時花粉具一定活力，隨著散粉量增多花粉活力逐漸上升于第2 d達到峰值，花粉活力開始迅速下降直至花藥干枯。三種方法測定花粉活力均值，碘-碘化鉀法>TTC法>花粉萌發法。圖1

表4 各因素質量濃度變色石竹花粉離體萌發率

注：A表示三個水平蔗糖濃度：B表示三個水平硼酸濃度，C表示三個水平氯化鈣濃度

Note:A presents three levels of sucrose concentration;B presents three levels of boric acid concentration; C presents three levels of calcium chloride concentration

表5 L9(33)正交試驗方差

2.4 柱頭形態及可授性

研究表明，開花第1～2 d，花柱較短長度約為4.2 mm，柱頭白色無絨毛，不具有可授性；開花第3 d，花柱明顯增長，長度達到7.4 mm，柱頭微絨毛呈白色，部分柱頭具有可授性；開花第4 d，花柱長達8.4 mm，柱頭微絨毛呈淡粉色，具有可授性但可授性較弱；開花第5～7 d，花柱長度達到峰值8.6 mm，柱頭絨毛量明顯增多呈現粉色，形態表現為逐漸彎曲，可授性較強并在第6 d達到最強；開花第8天，花柱長度為8.1 mm，柱頭彎曲度增大，多絨毛呈粉色，柱頭具有可授性，可授性減弱；開花第9 d，花柱長度約為7.9 mm，柱頭彎曲度嚴重，部分絨毛出現干枯情況，柱頭可授性消失。表6

圖1 花粉萌發和染色比率

注：“-”表示柱頭不具可授性：“-/+”表示部分柱頭不具可授性；“+”表示柱頭具可授性；“++”表示柱頭可授性較強；“+ + +”表示柱頭可授性最強

Note: “-”represents it is without stigma receptivity any more;“-/+”represents it is with partial stigma receptivity;“+”represents it is with stigma receptivity;“+ +”represents it is with strong stigma receptivity;“+++”represents it is with the strongest stigma receptivity

3 討 論

蔗糖作為花粉萌發的碳源，也是花粉萌發及花粉管壁合成的主要營養物質來源，對花粉萌發具有重要的作用[15]，適當濃度的蔗糖還能夠平衡細胞內外的滲透壓。當蔗糖濃度過高時，細胞會發生質壁分離現象，而在試驗中并未發現有質壁分離的花粉細胞，說明蔗糖的濃度在合理范圍內。硼元素能夠與蔗糖形成絡合物，促進糖分的吸收和代謝，從而增加花粉糖含量，加強代謝活動[16]；此外，郭光明等[17]通過研究百合花粉發現硼對質外體結合鈣離子和游離鈣離子有影響，硼有可能對細胞內游離鈣離子也產生影響。英國學者通過觀察花粉管生長的全過程，得出一定濃度的鈣離子有利于合成膜蛋白，并且能夠調控花粉管生長的結論[18]。一定濃度的硼酸和氯化鈣能夠促進花粉萌發，有關花粉萌發的研究表明，花粉萌發是多個因子共同作用的結果，不同因素不同梯度對萌發的花粉具有促進或是抑制作用。

花粉生活力強弱，一方面由遺傳因素決定，另一方面又受到環境因素的影響。目前，在短時間內測定花粉活力的方法主要有離體萌發法和非萌發染色分析法[19]。

花粉活力及柱頭可授性研究是一個動態的過程，柱頭可授性是花朵成熟過程中的一個重要時期，它在很大程度上影響著授粉成功率[20]。變色石竹花粉活力較強時，柱頭不具有可授性，這可能與變色石竹避免自花傳粉的適應機制相關。

4 結 論

通過對變色石竹花期動態記錄得出，變色石竹開花期在5月下旬，最佳觀賞時間即盛花期于6月初一直延續到9月底，連續花期長達165 d左右，并且花形優美，花部圖案多變，花期較長，具備一定的觀賞價值。

比較適合變色石竹花粉培養配方為：蔗糖10 g/L+硼酸0.1 g/L+氯化鈣0.05 g/L。其中，蔗糖、硼酸對花粉萌發影響較大，氯化鈣對花粉萌發具有一定的影響。

運用三種方法測定變色石竹花粉活力，兩種染色法測得花粉活力均高于體外萌發法，但三者趨勢保持一致，并從不同角度反映花粉活力?；ǚ勖劝l法對花粉活力測定較為準確，但不同植物花粉萌發培養基差異較大，操作起來比較繁瑣；碘-碘化鉀染色法簡便易行，但對花粉的生活力估計偏高，會使沒有活力的花粉著色；TTC染色法操作簡便并能夠較好的反應花粉活力情況。

對柱頭可授性測定得出，變色石竹花粉活力最高時柱頭還不具有可授性，而柱頭可授性最強表現在第6 d，此時花粉活力較低。

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Fund project:Supported by Shanghai scientific technology agriculture development project(207110008)and College students' innovative entrepreneurial training program of Xinjiang Agricultural University(201510758003)

Pollen Viability and Stigma Receptivity of Dianthus versicolor in Xinjiang

MA Ji-kai, DONG Lian-xin

(College of Forestry and Horticulture Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)

【Objective】 The project aims to measure the flower biological characteristics, regulation of pollen viability and stigma receptivity in order to provide basic theory toDianthusversicolorgermplasm utilization and cross pollination.【Method】By observing dynamicD.versicolorflower bloom and surveying organ of flower to research the effects of sucrose, boric acid and calcium chloride onD.versicolorpollen germination, the trial usesD.versicolorpollen by L9 (33) orthogonal design.【Result】(1)D.versicolorbloomed in the middle of May. The peak of flowering was from June to September and flowering duration lasted 165 days in total. (2) The best pollen medium component was that 10 g/L sucrose, 0.1 g/L boracic acid, 0.05 g/L calcium chloride. (3) Pollen viability had vitality after flowering 6 hour to 6 days, and the highest pollen viability appeared two days after the flowering. (4) Stigma receptivity enhanced gradually from the third flowering day and disappeared 8 days later.【Conclusion】D.versicolorflowering patterns are changeable with a long time flowering period so it is a kind of valuable ornamental plant. Sucrose, boric acid and calcium chloride could promote the pollen germination. TTC staining method is an easy and accurate method to test pollen viability. This method tells us that stigma receptivity is the highest within the 4-6 flowing days.

Dianthusversicolor; culture media; pollen viability; stigma receptivity

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.018

2016-03-16

上?？萍寂d農項目(214110008)；新疆農業大學大學生創新創業訓練計劃項目(201510758003)

馬際凱(1990-)，男，貴州人，碩士研究生，研究方向為野生花卉引種栽培，(E-mail)xj_mjk@163.com

董連新(1963-)，男，江蘇人，副教授，博士，碩士生導師，研究方向為植物野生資源及分類，(E-mail)dlx-xj@163.com

S682.1+9

A

1001-4330(2016)07-1303-07