胃潰瘍肝郁證候大鼠模型的建立及其評價

孫劍端 任路 鄧雪 傅沈康 李靜

摘要：目的 探討胃潰瘍肝郁證候動物模型的建立及電針的治療作用。方法 采用Open-field法選擇60只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機分為空白組、模型組、模型對照組和電針組，每組15只。除空白組外，其余3組均采用慢性不可預(yù)見性刺激合并醋酸燒灼法建立胃潰瘍抑郁證大鼠模型。模型對照組繼續(xù)慢性不可預(yù)見性刺激，電針組電針“肝俞”“梁丘”治療，連續(xù)13 d。觀察大鼠一般狀態(tài)、曠場實驗結(jié)果、潰瘍指數(shù)，RT-PCR檢測海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），ELISA檢測血清胃泌素（GAS）含量。結(jié)果 實驗第21日，除空白組外其余3組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、四肢無力、被毛乏澤、食欲降低等表現(xiàn)。實驗第34日，模型對照組大鼠一般狀況表現(xiàn)較模型組嚴(yán)重，電針組大鼠一般狀況明顯改善，模型組大鼠水平和垂直穿格數(shù)較空白組顯著減少（P<0.01），與模型組比較，模型對照組大鼠水平和垂直穿格數(shù)顯著減少（P<0.05），電針組大鼠水平和垂直穿格數(shù)顯著增加（P<0.01）；模型組大鼠潰瘍指數(shù)較空白組顯著升高（P<0.01），與模型組比較，模型對照組大鼠潰瘍指數(shù)顯著升高（P<0.05），電針組大鼠潰瘍指數(shù)顯著下降（P<0.01）；模型組海馬組織BDNF mRNA表達(dá)較空白組顯著下降（P<0.01），與模型組比較，模型對照組海馬組織BDNF mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05），電針組海馬組織BDNF mRNA表達(dá)組顯著升高（P<0.01）；模型組大鼠GAS含量較空白組顯著升高（P<0.01），與模型組比較，模型對照組大鼠GAS含量顯著升高（P<0.05），電針組大鼠GAS含量顯著降低（P<0.05）。結(jié)論 通過復(fù)合方式建立病證結(jié)合胃潰瘍肝郁證候動物模型可行，電針“肝俞”和“梁丘”對該模型有治療作用。

關(guān)鍵詞：胃潰瘍；肝郁；模型；電針；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.014

中圖分類號：R228；R332 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）09-0056-05

Establishment and Evaluation of Gastric Ulcer Liver Depression Syndrome Rat Model SUN Jian-duan1， REN Lu2， DENG Xue2， FU Shen-kang2， LI Jing3 （1. 521 Hospital of Norinco Group， Xian 710000， China； 2. College of Acupuncture and Massage， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China； 3. Shaanxi Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xian 710000， China）

Abstract： Objective To discuss the establishment of gastric ulcer liver depression syndrome rat model and the therapeutical effects of electroacupuncture. Methods As the result of Open-field experimental method， 60 SPF male SD rats were selected as experimental animals. After 7 days of adaptive feeding， 60 rats were randomly divided into blank group， model group， model control group， and electoracupuncture group， 15 rats in each group. Except for the blank group， the other three groups were stimulated by chronic unpredictable stimulation to establish rat depression model. Then model control group was once again stimulated by chronic unpredictable stimulation for 13 days； electoracupuncture group was treated at Gan Shu （BL18） and Liang Qiu （ST34） acupoints for 13 days. General state of rats， Open-field experimental results and gastric ulcer index were observed. BDNF was measured by RT-PCR. GAS content was measured by ELISA. Results After modeling for 21 days， except for the blank group， the other three

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81373718）；遼寧省自然科學(xué)基金（2013020179）；遼寧省教育廳科學(xué)研究項目（L2012339）； 遼寧省科技攻關(guān)項目（2009225010-36）；沈陽市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展與科技攻關(guān)計劃（F12-193-9-37）；沈陽市科技局應(yīng)用基礎(chǔ) 研究專項（F13-318-1-67）

groups appeared listlessness， limb weakness， and fur dry and lose luster， appetites reduced， etc. After modeling for 34 days， compared with model group， model control group had more severe general state than model group. After acupuncture treatment， the general state of acupuncture group was improved. The horizontal and vertical activity sore in model group decreased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the horizontal and vertical activity sore in model control group decreased significantly （P<0.05）， and increased significantly in the electroacupuncture group （P<0.01）. Ulcer index in the model group increased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Ulcer index in the model control group increased significantly compared with the model group （P<0.01）. Ulcer index in electroacupuncture group decreased significantly （P<0.01）. BDNF mRNA expression in hippocampus of model group decreased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with model group， the BDNF mRNA expression in hippocampus of model control group decreased significantly （P<0.05）. The BDNF mRNA expression in the electroacupuncture group increased significantly （P<0.01）. The GAS content in the model group increased significantly compared with the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the GAS content in the model control group increased significantly （P<0.05）. The GAS content in the electroacupuncture group decreased significantly （P<0.05）. Conclusion The establishment of depressive rat gastric ulcer model which combining disease and syndrome together proves the feasibility of this animal experimental model. Electroacupuncture for Gan Shu （BL18） and Liang Qiu （ST34） can improve the efficacy of this model.

Key words： gastric ulcer； depression； animal models； electroacupuncture； rats

隨著生物醫(yī)學(xué)模式向社會-心理-生物醫(yī)學(xué)模式轉(zhuǎn)變，越來越多的疾病受到情感情緒變化的影響。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，情志不遂、憂思惱怒、肝氣郁結(jié)可致胃脘疼痛、納呆、脹滿。清代葉天士提出“肝為起病之源，胃為傳病之所”，強調(diào)情志因素在脾胃病中的重要作用。有研究顯示，消化性潰瘍和功能性胃腸疾病的發(fā)生與抑郁情緒密切相關(guān)[1-2]。本實驗依據(jù)上述理論，探討胃潰瘍肝郁證候模型的建立及電針的治療作用，為建立病證結(jié)合的動物模型提供參考。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，2月齡，體質(zhì)量140～200 g，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SCXK（遼）2010-0001。飼養(yǎng)于室溫18～23 ℃、相對濕度35%環(huán)境，每日光照時間約為11 h。

1.2 主要試劑與儀器

10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），DAB顯色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司），腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）擴增產(chǎn)物（北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限公司），DL2000 DNA marker（北京全氏金生物科技有限公司），胃泌素（GAS）ELISA試劑盒（上海越研生物科技有限公司）。自制曠場實驗箱（80 cm×80 cm×40 cm），并將曠場等分為25小格；酶標(biāo)儀、PCR儀、電泳儀，北京六一儀器廠；電針治療儀，廣東汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠；華佗牌0.25 mm×25 mm不銹鋼針灸針，蘇州醫(yī)療器械。

2 實驗方法

2.1 分組

采用Open-field法[3]進(jìn)行行為學(xué)評分，選擇得分相近的60只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機分為空白組、模型組、模型對照組、電針組，每組15只。

2.2 造模

抑郁癥大鼠模型參照文獻(xiàn)[4]方法并改良，制作傳統(tǒng)慢性不可預(yù)見性刺激模型，造模21 d。刺激：斷水、斷食24 h，夾尾5 min；搖晃：1次/s，連續(xù)5 min；晝夜顛倒；電擊足底，電壓50 mV，每5 s刺激1次，間歇5 s，共刺激10次；束縛2 h（使大鼠頭部在行為限制筒的開口端，不影響其呼吸為宜）。每日隨機選擇1種刺激，每種刺激平均使用3次，2 d內(nèi)同一刺激不在相同個體上重復(fù)執(zhí)行，共21 d。

參照文獻(xiàn)[5]制作胃潰瘍模型。抑郁癥造模第10日進(jìn)行胃潰瘍模型的制作，實驗前大鼠禁食24 h，不禁水，稱重，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，胸腹部剃毛、消毒、打開腹腔（手術(shù)切口長約2 cm），暴露出胃，在胃竇近胃體處漿膜層下注射90%冰醋酸0.01 mL，注射后胃壁表面立即形成一個圓形或橢圓形隆起，然后隆起變平出現(xiàn)一個圓形或橢圓形的乳白色不透明區(qū)，直徑為4～5 mm，用縫線將大網(wǎng)膜固定于注射區(qū)，以防穿孔，逐層縫合切口，涂上一層稀釋的火棉膠，保護(hù)傷口。胃潰瘍造模成功后繼續(xù)進(jìn)行慢性不可預(yù)見性刺激，刺激滿21 d 為止。

2.3 干預(yù)

模型組給予抓取固定刺激13 d；模型對照組繼續(xù)進(jìn)行慢性不可預(yù)見性刺激13 d；電針組每日行電針治療，穴位選擇參照《實驗針灸學(xué)》取穴[6]。在大鼠安靜狀態(tài)下，針刺雙側(cè)“梁丘”（雙后肢膝關(guān)節(jié)外上5 mm處，直刺4～5 mm），“肝俞”（大鼠背部、約第9胸椎棘突下兩旁肋間，直刺6 mm）。針刺手法采用平補平瀉。電針治療儀將同側(cè)“肝俞”“梁丘”接正負(fù)極，給予電壓2 V，疏密波型，疏波4 Hz，密波20 Hz，強度以局部皮膚肌肉輕微顫動為度，留針20 min，每日1次，連續(xù)6 d，中間休息1 d，2周為1個療程，共13 d。實驗結(jié)束時，剔除實驗中死亡大鼠，空白組、模型組、模型對照組、電針組各取10只。 2.4 一般狀況觀察

實驗過程中觀察記錄大鼠一般情況，包括體質(zhì)量、飲食飲水、活動度、精神狀態(tài)、毛色等。

2.5 曠場實驗

所有實驗大鼠實驗第1日（實驗開始前）、第21日（造模結(jié)束后）、第34日（治療后）進(jìn)行曠場實驗。用白線將自制曠場實驗箱劃分成25個16 cm×16 cm小正方形。實驗時選在安靜的房間，將大鼠放在中央格子中，同時用攝像機記錄大鼠運動行為。3 min/只觀察水平運動、垂直運動（以動物四爪全部穿越的格數(shù)為準(zhǔn)）。

2.6 指標(biāo)檢測

實驗結(jié)束后大鼠禁食12 h，經(jīng)腹主動脈采血，靜置4 h，4000 r/min離心5 min分離血清，取上清液，4 ℃冰箱冷藏備用。ELISA檢測血清GAS，按照試劑盒說明書進(jìn)行。斷頸處死大鼠充分暴露腹腔，取出整胃，沿胃大彎剪開，將胃平鋪在濾紙上，內(nèi)膜向上，顯露潰瘍面，采用GUTH法計算潰瘍指數(shù)[7]。損傷≤1 mm（包括斑點糜爛）計1分，1 mm<損傷≤2 mm計2分，2 mm<損傷≤3 mm計3分，3 mm<損傷≤4 mm計4分，損傷≥4 mm計5分。切下大鼠頭顱，冰上開顱，剝?nèi)〈竽X海馬組織，放入EP管中，-80 ℃冰箱凍存，加入裂解液，使用勻漿機將組織徹底研磨，氯仿抽提，12 000 r/min離心并提取上層水相，去蛋白并離心等，重新溶解RNA；鑒定RNA提取純度；將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，鑒定cDNA純度。PCR反應(yīng)引物序列：BDNF上游5'-GGGGTTAGGAGAA GTCAAGC-3'，下游5'-CAGTGGGACTCCAGAAGA CA-3'，擴增產(chǎn)物長度288 bp；β-actin上游5'-ATC ATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，下游5'-CATCTC TTGCTCGAAGTCCA-3'，擴增產(chǎn)物長度318 bp，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。利用條帶亮度表示BDNF mRNA的含量，亮度越強則含量越高，表明海馬BDNF mRNA表達(dá)數(shù)量越多；反之，則表明mRNA表達(dá)越少。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析和LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況結(jié)果

造模前4組大鼠一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，精神狀態(tài)良好，行動迅速，飲食正常，排泄正常，體質(zhì)量增加。實驗21日除空白組外其余3組大鼠一般狀況較差，眼常閉著、精神萎靡、俯臥蜷縮、四肢無力、拱背少動、體毛干枯無光澤、食欲降低，大便變軟、顏色較淺、少數(shù)呈稀糊狀，潰瘍術(shù)后數(shù)日內(nèi)曾有黑便。實驗34日空白組大鼠狀態(tài)同造模前，模型組大鼠一般狀況較差，大鼠被毛乏澤蓬松、反應(yīng)遲緩、精神不振、活動度減少、食欲降低、體質(zhì)量增加緩慢，大便變軟、顏色較淺、少數(shù)呈稀糊狀；模型對照組大鼠一般狀況較模型組嚴(yán)重，大鼠毛色變暗、枯黃，眼睛瞇小、有眼屎，胡須下垂、叫聲尖細(xì)、貼邊扎堆及蜷曲蹲伏，少食厭食，消瘦，體質(zhì)量減輕，便質(zhì)大多稀溏；電針組大鼠一般狀態(tài)恢復(fù)較好，被毛恢復(fù)光澤，精神狀態(tài)正常，飲食好轉(zhuǎn)，大便質(zhì)地恢復(fù)正常。

4.2 曠場實驗結(jié)果

造模前各組水平和垂直活動與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；造模后各組水平活動和垂直活動與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明大鼠在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度有所改變，符合抑郁癥模型行為學(xué)的改變。治療第34日，模型對照組在慢性不可預(yù)見性刺激下大鼠水平和垂直穿格數(shù)較模型組顯著減少（P<0.05），說明慢性不可預(yù)見性刺激可加重抑郁傾向；電針組較模型組大鼠水平和垂直穿格數(shù)顯著增加（P<0.01），表明電針“肝俞”“梁丘”，可改善大鼠的抑郁狀態(tài)。結(jié)果見表1、表2。

4.3 電針對模型大鼠潰瘍指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組潰瘍指數(shù)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，模型對照組潰瘍指數(shù)顯著升高（P<0.05），電針組潰瘍指數(shù)顯著下降（P<0.01）。 結(jié)果見表3。

4.4 電針對模型大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.01）；與模型組比較，模型對照組大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05），電針組大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)升高（P<0.01）。結(jié)果見圖1、表4。

4.5 電針對模型大鼠血清胃泌素含量的影響

模型組較空白組GAS含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，模型對照組GAS含量顯著增加（P<0.05），電針組GAS含量顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表5。

5 討論

消化性潰瘍患者在臨床上表現(xiàn)出具有較強的抑郁和/或焦慮的負(fù)面情感因素，其心理異常率明顯高于正常人群[8]。這種高發(fā)率的抑郁癥狀尤其表現(xiàn)在綜合醫(yī)院門診及住院患者身上[1]。為了有效、深入地研究該病的發(fā)病機制以及電針的治療作用，建立有效可行的動物模型十分重要。

目前大鼠潰瘍模型中以冰醋酸性模型在實驗研究中應(yīng)用較廣[9]。本實驗選用注射冰醋酸燒灼法復(fù)制慢性胃潰瘍模型，直接以冰醋酸燒灼胃漿膜形成潰瘍。此模型方法可靠，重復(fù)性好，潰瘍深而大，與人類的慢性胃潰瘍極為相似[10]。慢性不可預(yù)見性刺激抑郁癥動物模型作為環(huán)境應(yīng)激模型的一種，更接近于理想的抑郁癥模型，即能模擬人類抑郁癥的核心癥狀，模型可操作性和可復(fù)制性好，為抑郁癥發(fā)病機制的研究提供良好的模型基礎(chǔ)。有研究表明，長期不可預(yù)見的中等強度應(yīng)激造成的大鼠抑郁癥模型，表現(xiàn)出一系列情緒行為改變，與人類抑郁癥有一定相似性[11]。中醫(yī)認(rèn)為長期情志不良可導(dǎo)致消化道疾病的出現(xiàn)，且二者互相影響。單純的情志刺激在動物實驗很難出現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)的消化道疾病，不具有可行性，需要人為控制的因素很多，包括時間周期的長短選擇。因此，我們將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抑郁癥造模方法和胃潰瘍造模方法結(jié)合，先開始一段時間的抑郁癥造模，再在此基礎(chǔ)上進(jìn)行冰醋酸燒灼法復(fù)制胃潰瘍模型。選擇海馬組織BDNF和血清GAS作為判斷胃潰瘍肝郁的指標(biāo)，并作為電針治療后的參照量，用反證法說明此模型的可行性；并通過模型對照組和模型組的比較，體現(xiàn)出長期反復(fù)的不可預(yù)見性刺激對于潰瘍的愈合確有一定影響。

動物模型的評價，通常用表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測效度進(jìn)行綜合評價[12]。就本實驗來言，表面效度即通過大鼠一般行為、曠場實驗結(jié)果顯示，模型動物的情緒表現(xiàn)類似于人類相應(yīng)情緒表現(xiàn)。造模結(jié)束后，除空白組外，其余3組大鼠一般狀況較差，出現(xiàn)精神萎靡、俯臥蜷縮、拱背少動、體毛干枯乏澤、食欲降低等改變；模型對照組再繼續(xù)慢性不可預(yù)見性刺激，其一般狀況較之前更差；曠場實驗結(jié)果顯示，模型對照組大鼠活動度較模型組明顯減少。結(jié)構(gòu)效度是通過潰瘍指數(shù)、海馬組織BDNF和血清GAS的改變表明動物模型與人類疾病產(chǎn)生的原因具有相似性。實驗結(jié)果顯示，潰瘍指數(shù)模型對照組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明繼續(xù)慢性不可預(yù)見性刺激或不良情志的刺激，可加重潰瘍的形成。BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員之一，參與抑郁的病理生理過程，是抑郁障礙的易感基因，BDNF及其受體水平下降可能是導(dǎo)致抑郁癥的主要發(fā)病機制。實驗結(jié)果顯示，模型對照組海馬組織BDNF mRNA表達(dá)較模型組減少，表明不良的情志刺激可加重抑郁狀態(tài)，與前期研究結(jié)果一致。GAS作為一種胃腸道內(nèi)分泌激素，其血清表達(dá)量與胃潰瘍的發(fā)生呈正相關(guān)趨勢。在臨床實踐中，血清GAS含量的變化被認(rèn)為是消化道炎癥和/或潰瘍患者的血清學(xué)標(biāo)志物[13]。實驗結(jié)果顯示，模型對照組血清GAS含量增加，加重或促進(jìn)了潰瘍的形成。預(yù)測效度是通過電針組與模型組的比較，說明電針對此模型具有治療作用。電針“肝俞”“梁丘”后，大鼠活動度明顯增加，潰瘍指數(shù)較模型組減少，大鼠海馬組織BDNF mRNA表達(dá)升高，血清GAS含量較模型組減少。通過以上3種效度的綜合評價，可以說明此模型具有可行性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蘇銳，郭艷榮，趙妍芳.心理因素對功能性胃腸病患者生活質(zhì)量的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2009，12（15）：1404-1405，1409.

[2] 楊玉芹，江新華.不同職業(yè)消化性潰瘍住院患者抑郁基線狀況調(diào)查及分級干預(yù)策略[J].中國老年保健醫(yī)學(xué)，2008，6（6）：9-10.

[3] KATZ R J， ROTH K A， CARROLL B J. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat：implications for a model of depression[J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews，1981，5（2）：247-251.

[4] WILLNER A， TOWELL D， SAMPON S， et al. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress， and its restoration by a tricyclic antidepressant[J]. Psychopharmacology （Berl），1987， 93（3）：358-364.

[5] 王英.冰乙酸性大鼠胃潰瘍模型制作方法比較[J].實用診斷與治療雜志，2007，21（7）：505-506.

[6] 李忠仁.實驗針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：317.

[7] GUTH P H， AURESS D， PAULSEN G. Topical aspirin plus HCl gastric lesion in the rat. Cytoprotective effect of prostaglandin， cimetidine， and probanthine[J]. Gastroenterlogy，1979，76（1）：88-93.

[8] 孫琪，徐志偉.情志致病內(nèi)涵解析[J].上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（6）：57-59.

[9] 楊玉芹，江新華.不同職業(yè)消化性潰瘍住院患者抑郁基線狀況調(diào)查及分級干預(yù)策略[J].中國老年保健醫(yī)學(xué)，2008，6（6）：9-10.

[10] 許宏俐.益氣化瘀煎劑抗大鼠胃潰瘍作用及其機制探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，1998，4（9）：208-210.

[11] PAUL WILLNER. Validity， reliability and utility of the chronic mild stress model of depression：a 10-year review and evaluation[J]. Psychopharmacology （Berl），1997，134（4）：319-329.

[12] YAMAMOTO T， UNE T. Animal models of psychiatric disorder and their validity from the perspective of behavioral pharmacology[J]. Nihon Yakurigaku Zasshi，2002，120（3）：173-180.

[13] 藍(lán)宇，尹洪民.胃泌素和血管內(nèi)皮生長因子在老年消化性潰瘍中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（14）：1723-1724.