劉煒婳，林爭春，馮 新，賴鐘雄

(福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

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天寶蕉HOS1基因啟動子克隆及生物信息學分析

劉煒婳，林爭春，馮 新，賴鐘雄*

(福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

以天寶蕉葉片為材料，分離天寶蕉HOS1基因的啟動子，并進行生物信息學分析。結果表明：天寶蕉HOS1啟動子與馬來西亞小果野蕉HOS1啟動子序列相似性達到92.43%，并含有35種類型順式作用元件，其中含有多種類型的激素應答作用元件和非生物脅迫有關的順式作用元件，可能與天寶蕉的冷脅迫應答有密切關系；天寶蕉HOS1啟動子預測含有2個CpG島， 暗示天寶蕉的冷脅迫應答與甲基化也有密切的關系。

天寶蕉Musaacuminata, AAA group；HOS1；啟動子；克隆；生物信息學分析

香蕉Musaspp.是芭蕉科Musaceae芭蕉屬Musa大型草本植物，其主要分布于東、西、南半球南北緯度30°以內的熱帶、亞熱帶地區。世界上栽培香蕉的國家有130多個，我國是香蕉主產區之一。不管是作為大宗水果，還是作為許多國家的主要糧食作物，香蕉的產量對于許多國家的糧食安全或重要水果都具有重要的作用[1]。香蕉具有喜高溫多濕，忌寒冷的生長習性[2]，香蕉生長的臨界溫度為13℃[3]，而我國香蕉栽培的亞熱帶地區在冬春季常常因遭受低溫的侵襲，使得香蕉的生長以及產量受到嚴重影響[4-5]。就如2016年1月23、24日，全國大范圍遭受西伯利亞寒流的侵襲，一些亞熱帶和熱帶地區的溫度為幾十年最低，福建、廣東、廣西等地區甚至出現了降雪，福建省遭遇了30年來的極端低溫，一些地區最低溫跌破0℃，甚至達到-4℃。這種極寒的天氣使得栽培香蕉的生長經歷了嚴峻的考驗。福建漳州天寶鎮是福建省香蕉的主栽地區，香蕉種植面積達1 300多 hm2，天寶蕉在這次寒流中受災范圍達90%，一些香蕉的葉片完全呈水漬狀。因此，研究與培育抗寒的香蕉栽培種是目前較為迫切的生產上問題。

植物在長期進化過程中，逐步形成了一套復雜而高效的應答機制，能以不同的途徑或者綜合幾條途徑來提高自身的抗寒性，抵御和適應低溫脅迫[6]。在眾多抗寒途徑中，DREB亞家族轉錄因子中的A-1亞組[也稱DREB1/CBF(C-repeat binding factor)亞組]轉錄因子在植物低溫應答過程中起著關鍵調控作用[7-9]。而在擬南芥CBF抗寒途徑中，ICE1能特異的與CBF3啟動子區域的 E-Box 結合，從而激活CBF3 及其下游靶基因的表達，顯著提高植株的抗寒性[10]。ICE1蛋白的轉錄活性受翻譯后修飾的嚴謹調控，主要包括SIZ1(SAP and Miz 1)介導的 SUMO(small ubiquitin- related modifier)化修飾和HOS1(high expression of osmotically responsive gene 1)介導的泛素化修飾，HOS1-SIZ1 系統精細嚴謹地調控著 ICE1-CBFs 及其靶基因的表達，以適應外界溫度的變化[9,11-12]。因此，在植物CBF抗寒途徑中，HOS1作為負調控因子起著重要的作用[13]。

有研究表明，在植物抗寒基因工程中采用誘導型啟動子比采用組成型啟動子效果更好[14-15]。因此，本研究克隆了天寶蕉Musaacuminata，AAA group的HOS1啟動子，并對啟動子序列進行生物信息學分析，以期為研究栽培香蕉的冷脅迫應答機制和培育高抗寒能力新品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以天寶蕉Musaacuminata, AAA group的葉片(福建農林大學園藝植物生物工程研究所香蕉種質資源圃)為材料，提取DNA，用于天寶蕉HOS1啟動子克隆。

1.2 方法

1.2.1 天寶蕉葉片基因組DNA的提取及其質量檢測 天寶蕉葉片基因組DNA的提取參照馮新[16]的方法。

1.2.2 天寶蕉HOS1啟動子克隆 參考香蕉Musaaccuminata, AA group基因組HOS1啟動子序列信息，利用DNAMEN6軟件工具進行天寶蕉HOS1啟動子克隆引物的設計，在起始密碼子ATG上游約1 900 bp的地方設計上游引物，在起始密碼子ATG下游約350 bp的地方設計下游引物。上游引物為HOS1proF：TGA TGA CTT CTC TGT GCA ACT，下游引物為HOS1proR：ACT CAA TTC TCT CTC ATT CCA C。退火溫度為57℃，目的片段大小為2 248 bp，延伸時間為2 min。以天寶蕉葉片DNA為模板，經PCR擴增后，將PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小與預測的片段大小相符，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0試劑盒(TaKaRa公司)將目的片段切膠回收，然后連接至pMD 18-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性單克隆子，進行菌液PCR鑒定后送測序。引物合成及產物測序委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行。

1.2.3 天寶蕉HOS1啟動子生物信息學分析 天寶蕉HOS1啟動子生物信息學分析的方法有：利用DNAMEN6軟件工具進行天寶蕉HOS1啟動子序列分析及和香蕉基因組HOS1啟動子序列多序列比對；利用BDGP在線預測工具對啟動子中轉錄起始位點及可能的核心啟動子區域進行預測(http://www.fruitfly.org/ seq_tools/promoter.html)；利用PlantCARE對啟動子中可能存在的順式作用元件進行預測(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)；利用CpG Islands對啟動子區域潛在的CpG島進行預測(http://www. bioinformatics.org/s ms2/cpg_islands.html)。

2 結果與分析

2.1 天寶蕉HOS1 5端調控序列的獲得及與香蕉基因組序列的比較分析

以之前準備好的天寶蕉葉片DNA為模板，結合設計的引物進行PCR擴增后，在2 000 bp左右的地方出現了一條特異條帶(圖1)與預測的片段大小相符，切膠回收目的條帶，加以純化，進行后續克隆。菌液PCR后，挑選單一較亮的目的條帶的菌液送去測序。測序結果得到2 266 bp的DNA序列，經分析，去掉起始密碼子ATG及下游的364 bp DNA序列，去掉同一染色體上HOS1上游基因3’UTR的277 bp DNA序列，共得到1 624 bp的HOS1 5端調控序列。將天寶蕉和香蕉Musaaccuminata, AA group基因組HOS1啟動子序列進行多序列比對分析(圖2)，二者相似性為92.43%。從序列比對可以看出，總體上二者序列具有較高的同源性，又具有一定的差異，這些序列的差異主要集中在啟動子區域的下游，這些差異符合5’調控序列的特異性。在一些香蕉不同品種中有出現類似的現象[16]，因此推測這種現象也可能是物種間差異決定的。

2.2 天寶蕉HOS1啟動子轉錄起始位點的預測

利用BDGP工具進行天寶蕉HOS1啟動子轉錄起始位點在線預測。預測結果表明，天寶蕉HOS1啟動子中可能存在一處核心啟動子區域，分布于-449～499 bp區域，預測分值為：0.82，可能的轉錄起始位點分別為：A，可能的轉錄起始區域為：AGC GGT GGG TGA AAA AAT CTC TCC ATC CTT CAG CTC TTC TAA TCA TAA AA。

2.3 天寶蕉HOS1啟動子順式作用元件的預測

利用PlantCARE工具進行天寶蕉HOS1啟動子順式作用元件在線預測，結果如圖3。從圖中可以看出天寶蕉HOS1啟動子共有35種類型順式作用元件。除了含有大量核心啟動子元件TATA-box(32個)和CAAT-box(35個)外，還含有多種類型的順式作用元件。其中光響應作用元件多達10種，分別為AT1-motif、Box 4、Box I、CATT-motif、G-Box、G-box、GA-motif、GT1-motif、Skn-1 motif、TCT-motif; 其次，還有多種激素應答作用元件，如：參與脫落酸反應的順式作用元件ABRE(1個)，參與赤霉素反應的順式作用元件GARE-motif(1個)，參與乙烯反應的順式作用元件ERE(1個)。

值得注意的是，天寶蕉HOS1啟動子含有一些與非生物脅迫有關的順式作用元件，如參與低溫脅迫的LTR順式作用元件(1個)、參與熱脅迫的HSE順式作用元件(3個)以及參與干旱誘導的MYB綁定位點MBS順式作用元件(1個)。

另外還有參與生物鐘反應(circadian)、參與胚乳表達(SKN-1 motif)、參與玉米蛋白代謝作用(O2-site)、參與特異分生組織表達(CCGTCC box)、真菌誘導子響應(Box-W1)、MYBHv1綁定位點(CCAAT-box)和一些未知的順式作用元件。

2.4 天寶蕉HOS1啟動子CpG島的預測

利用在線預測軟件CpG Islands預測天寶蕉HOS1啟動子序列的CpG島，設定預測條件為：間隔至少100 bp，其中GC所占的比例超過50%，且CpG的實際值/期望值大于0.6。預測結果表明，天寶蕉HOS1啟動子序列有2個CpG島分布區域：第1個CpG島分布區域為-1 023～1 126 bp，大小為104 bp。第2個CpG島分布區域為-1 186～1 525 bp，大小為340 bp(圖4)。

3 討 論

3.1 天寶蕉HOS1啟動子含有種類繁多的順式作用元件

啟動子預測分析表明，天寶蕉HOS1啟動子共含有35種類型的順式作用元件，意味著HOS1具有復雜的表達調控機制。這些順式作用元件與相應的轉錄因子結合，發揮著多種功能。其中光響應順式作用元件最多，達到10種。此外，還含有多種激素響應順式作用元件，和一些其他的順式作用元件。值得注意的是，天寶蕉HOS1啟動子含有低溫、熱脅迫和干旱誘導的非生物脅迫順式作用元件，這說明HOS1在植物應答非生物脅迫的時候，具有潛在的重要作用，這也佐證了擬南芥中HOS1在CBF抗寒途徑中的負調控作用[13]。至于HOS1啟動子中參與低溫脅迫的LTR順式作用元件在CBF抗寒途徑中發揮負調控作用的具體機制，有待進一步的研究。

3.2 天寶蕉HOS1含有的多種激素應答作用元件為提高抗寒能力提供了新的線索

天寶蕉HOS1啟動子含有多個激素(赤霉素、脫落酸、乙烯)響應順式作用元件，激素與植物低溫適應性關系密切，且已經在很多植物中報道了這些激素與提高植物抗寒性的關系[17-21]。預測分析結果顯示，天寶蕉HOS1啟動子含有多個激素響應順式作用元件，已有的報道指出外源施加赤霉素、ABA和乙烯利能提高植物的抗寒性。但外源施加激素在栽培香蕉上的研究很少，本研究預測到天寶蕉的HOS1啟動子中含有這些激素響應順式作用元件，暗示可能通過外源施加激素來提高天寶蕉的抗寒性。

3.3 天寶蕉HOS1的冷脅迫應答可能與甲基化過程有密切關系

DNA甲基化在植物生長發育過程中起著重要的作用[21-22]。DNA甲基化主要發生在 CpG 雙核苷酸序列中的胞嘧啶上[23]。DNA甲基化水平也決定著基因的表達，高水平的甲基化會抑制基因的表達，低水平的甲基化會增強基因的表達[24]。DNA甲基化除了在植物生長發育過程中的作用，還參與了植物各種逆境脅迫應答過程，調控植物逆境應答基因的表達，進而提高當代植物對逆境的適應能力[25-27]。經歷脅迫的植物，其后代抗脅迫的能力將增強，也會增強對其他脅迫的交叉抗性[28-29]，即使在沒有脅迫的條件下，其后代的基因組整體依然表現為超甲基化狀態[30]。非生物的逆境脅迫，如鹽、干旱、熱、抗生素等，都會引起甲基化水平的改變[22]。

生物信息學預測結果表明，天寶蕉HOS1啟動子含有2個CpG島。擬南芥中CBF抗寒途徑中HOS1起著負調控的作用，如果將HOS1啟動子5端甲基化將會引起轉錄水平的沉默，理論上將能提高植株的抗寒性，在具體應用上有待我們進一步驗證。天寶蕉HOS1啟動子中含有多個非生物脅迫的順式作用元件，這都有可能引起HOS1甲基化水平的改變，也進一步影響著基因的表達。

在植物CBF抗寒途徑中，ICE1蛋白的轉錄活性受翻譯后修飾的嚴謹調控，主要包括SIZ1介導的 SUMO化修飾和HOS1介導的泛素化修飾。有研究表明，降低組蛋白H2B的泛素化水平會引起H3出現低水平的甲基化[31]。哺乳動物中，組蛋白H2B泛素化對H3K4和H3K79的甲基化是必需的，且與H3K79的甲基化呈現負相關[32]。在CBF抗寒途徑中，HOS1介導的ICE1泛素化修飾與ICE1的 DNA甲基化之間是一種抑制關系還是一種正相關關系有待于進一步研究?；蛟S組蛋白泛素化與DNA甲基化之間復雜的關系對相關基因的活性的調節可能將會解釋更多現在無法解釋的現象。

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(責任編輯：柯文輝)

Cloning and Bioinformatic Analysis ofHOS1 Promoter from the ‘Tianbao’ Banana (Musaacuminata. AAA group)

LIU Wei-hua, LIN Zheng-chun, FENG Xin, LAI Zhong-xiong*

(InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

In this experiment，HOS1 promoter was cloned successfully from the ‘Tianbao’ banana, and was further bioinformatically predicted. The analysis results showed that the sequence similarity ofHOS1 promoter was 92.43% between the Tianbao banana and the wild banana in Malaysia, and the Tianbao banana promoter contained 35 kinds of cis-elements, including a variety of types of phytohormone response cis-elements and cis-elements concerning abiotic stress, which suggested that there be a close relationship with cold stress response in Tianbao banana. Tianbao bananaHOS1 promoter contained two CpG islands, which suggested it should also have a close relationship between cold stress response and methylation in Tianbao banana.

‘Tianbao’banana (Musaspp., AAA group)；HOS1；promoter；cloning；bioinformatic analysis

2016-05-10初稿；2016-07-15修改稿

劉煒婳(1986-)，女，博士生，研究方向：園藝植物生物技術

*通訊作者：賴鐘雄(1966-)，男，博士，研究員，研究方向：園藝植物分子生物學(E-mail:Laizx01@163.com)

福建省重大科技專項(2015NZ0002-1)；國家香蕉產業技術體系專項(CARS-32-11)

S 668.1

A

1008-0384(2016)08-820-06

劉煒婳，林爭春，馮新，等.天寶蕉HOS1基因啟動子克隆及生物信息學分析[J].福建農業學報，2016，31(8)：820-825.

LIU W-H，LIN Z-C，FENG X，et al.Cloning and Bioinformatic Analysis ofHOS1 Promoter from the ‘Tianbao’ Banana (Musaacuminata. AAA group) [J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：820-825.