新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離與鑒定

張貴會,王 賀,何春秋,楊 玲

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

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新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離與鑒定

張貴會,王 賀,何春秋,楊 玲

(1.塔里木大學生命科學學院,新疆阿拉爾 843300;2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室,新疆阿拉爾 843300)

采用色譜分離技術從藥桑葉醇提物的乙酸乙酯萃取部分分離黃酮類化合物,通過核磁共振(NMR)和高效液相-串聯質譜(HPLC-MS-MS)鑒定其結構。分離得到四個黃酮類化合物,結構表征為蘆丁(1)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(2)、金絲桃苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(4)。其中化合物(3)、(4)首次從新疆藥桑葉中分離得到。

藥桑葉(MorusnigraL.),黃酮,結構鑒定,槲皮素-3-O-葡萄糖苷,金絲桃苷

藥桑在植物分類學上屬桑科(Moraceac)、桑屬(MorusL.)、黑桑種(MorusnigraL.),是我國國內唯一具有22倍花性染色體的桑品種,是新疆目前桑品種分類鑒定中唯一黑桑種[1]。在新疆主要栽培地為南疆阿克蘇、庫車及和田地區,桑葉是桑科植物桑的葉,約占桑樹地上部產量的64%,桑葉是常用的維吾爾族醫藥材,可用于治療一些疾病,如關節腫痛、手足麻木等疾病[2]。桑葉含化學物質種類多,而且具有多種生物活性,黃酮類化合物是桑葉的主要功能性成分之一,主要包括蕓香苷、槲皮素、異槲皮素、二氫山奈素等[3-4],含量約占干質量的1.0%～3.0%[5]。研究表明桑葉中的黃酮類化合物,具有明顯的抗氧化活性[6-7]。

P. Bassinet等[8]從桑葉(Morusinsignis)70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇溶解部分分離得到2-甲基苯并呋喃類化合物、3-O-葡萄糖苷、熊果酸、莰非醇-3-0-葡萄糖苷和五羥黃酮-3-葡萄糖苷等化合物。N. Asano等[9]主要對桑白皮中的化學成分進行研究,從中分離得到桑根酮、桑酮醇、桑酮、二氫桑色素、二氫山奈酚、桑橙素等。Kim等[10]從桑葉中分離得到包括山萘酚、葡萄糖苷、紫云英苷等9個黃酮苷類化合物。陳菁菁等[11]從桑葉(Mulberry)中分離得到槲皮素葡萄糖苷、槲皮素蕓香苷、木犀草素蕓香苷等7個黃酮類化合物。鄭夢嬌等[12]從扶桑葉(Hibiscusrosa-sinensis)的乙醇提取物中分離得到芹菜素-3-C-阿拉伯糖-6-C-葡萄糖苷、山奈酚-C-六碳糖苷、菜素-C-二糖苷等4個黃酮類化合物。目前對于新疆藥桑葉中黃酮類化合物的研究主要集中在對蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素等含量的測定[13-14]。王芳等[15]對藥桑葉黃酮類化合物進行分離純化及活性研究,發現藥桑葉黃酮類化合物具有明顯的抗氧化活性。

目前對桑葉中黃酮類化合物分離及其活性有一定的研究,但對新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離純化和結構鑒定研究報道較少,本研究利用現代分離手段和色譜分離技術對藥桑葉黃酮類化合物進行分離純化,采用核磁共振(NMR)和高效液相-串聯質譜(HPLC-MS-MS)解析化合物的結構,旨在為更深入研究和開發新疆藥桑葉(MorusnigraL.)的藥用和經濟價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藥桑葉 2014年7月采自新疆庫車,經塔里木大學邱愛軍副教授鑒定為藥桑葉(MorusnigraL.),藥桑葉粉碎過100目篩備用;甲醇、甲酸 天津市風船化學試劑科技有限公司,為色譜純;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇 天津市光復科技發展有限公司,均為分析純;AB-8大孔吸附樹脂 天津市光復精細化工研究所;6410高效液相-串聯質譜 美國安捷倫公司;中壓柱色譜系統 上海樂風儀器設備有限公司,配有TBP5002型二元梯度液相泵、TBP-5000紫外檢測器、TBP-5001餾分收集器、進樣單元、ODS反相C18硅膠色譜柱(460 mm×36 mm,50 μm);2767Waters制備液相色譜 美國Waters公司,配有Waters2489雙波長紫外檢測器、四元梯度泵、自動進樣器和柱溫箱;島津LC-20AT型高效液相色譜儀,配有LC-20AT二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 取過100目篩的藥桑葉粉末5 kg,用體積分數80%的乙醇與藥桑葉粉末25∶1混勻在25 ℃下浸泡72 h,重復浸提3次,用布氏漏斗抽濾,合并濾液,減壓濃縮,加入等體積95%乙醇并置于4 ℃冰箱12 h使多糖沉淀,過濾除去多糖,濾液濃縮得浸膏0.7 kg,將浸膏用水分散,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇多次萃取,其中將乙酸乙酯萃取部分濃縮后備用。

1.2.2 黃酮類化合物的純化 取乙酸乙酯部分10 g用適量的水溶解,過濾,濾液過已活化的AB-8型大孔吸附樹脂依次用蒸餾水-乙醇體系進行梯度洗脫(100∶1;80∶20;60∶40;40∶60;20∶80;v/v),經薄層層析分析將流出部分分為(Ⅰ～Ⅴ)。

1.2.3 中亞柱色譜分離條件 取第Ⅲ部分用硅藻土拌樣,經中壓柱色譜(Flash反相C18色譜柱(460 mm×36 mm,50 μm);檢測器檢測波長328 nm,上樣量5 g),用蒸餾水-甲醇(90∶10;75∶25;50∶50;30∶70;0∶100;V/V),流速20 mL/min梯度洗脫,每段洗脫體積800 mL,得到Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5五段餾分,用高效液相色譜檢測各段餾分,餾分Fr1、Fr3、Fr4、Fr5中主要成分保留時間非常相近的化合物,經柱色譜和制備液相很難得到很好的分離,故不做下一步分離,本實驗只對餾分Fr2中各成分進行分離。

1.2.4 色譜分離條件 分析型液相色譜分離條件:色譜柱Waters-Xbridge(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;檢測波長328 nm;柱溫箱溫度40 ℃;進樣濃度1 g/L;進樣量20 μL;流動相甲醇-水;梯度洗脫(0～10 min 5%～25%甲醇、10～30 min 25%～75%甲醇、30～40 min 75%～100%甲醇),餾分Fr2中各化合物之間實現了基線分離。

制備型液相色譜分離條件:色譜柱為Waters-Xbridge(250 mm×19 mm,5 μm);流速15 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量為500 μL;樣品濃度為200 g/L;其余條件與分析型液相色譜條件相同。

1.2.5 單體化合物純度的測定 高效液相色譜條件:Waters-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;檢測波長328 nm;進樣量20 μL;柱溫40 ℃;流動相:水(A)-甲醇(B);等度洗脫(A∶B=65∶35;V/V)10 min。

1.2.6 質譜條件 質譜條件:負離子模式,離子源ESI;干燥氣:350 ℃;氣流:10 L/min;霧化壓力:40 psi;離子源溫度:330 ℃;電壓:4000 V;碎裂電壓:100 V;碰撞能量:10 V和40 V。

2 結果與分析

2.1 分離得到的單體化合物

其中Fr2餾分經制備型HPLC(5%～25%甲醇)得到化合物1(31 mg);(25%～75%甲醇)可得化合物2(6.3 mg)和化合物3(8.6 mg);(75%～100%甲醇)得到化合物4(7.8 mg)。

2.2 單體化合物純度測定

由圖1可知,由HPLC圖譜按峰面積歸一化法計算化合物1、化合物2、化合物3、化合物4的純度分別為97.7%、98.3%、97.0%、98.1%。化合物1、化合物3有兩個雜質峰,可能原因收集范圍寬所致,各化合物從保留時間上分析,化合物2保留時間3.8 min、化合物3保留時間4.0 min、保留時間微小差異可能原因是取代基的種類和數目相似,推測這兩種化合物可能是同分異構體,化合物1、化合物4保留時間差異很大可能與所連接的糖種類與數目有關,推測這四種化合物結構相似的黃酮類化合物。

圖1 單體化合物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of monomer compounds

2.3 黃酮類化合物質譜分析及可能結構

采用HPLC-MS-MS聯用技術,可以獲得每個色譜峰在負離子模式下所對應的質譜信息,由圖2可知,準分子離子峰[M-H]-(m/z 609)可知該化合物的相對分子質量為610,碎片離子峰(m/z 301)為準分子離子峰丟失一個中性片段m/z 308而產生的,根據相對分子質量初步判斷m/z 308的中性片段為蕓香糖,[M-H-308]-(m/z301)為槲皮素,與文獻一致[16]。

圖2 化合物ⅠESI-MS圖及結構Fig.2 Compound I ESI-MS diagram and structure

由圖3可知,在負離子模式下,準分子離子峰[M-H]-(m/z 463)可知該化合物的相對分子質量為464,碎片離子峰(m/z 301)是準分子離子峰丟失一個m/z 162的中性片段產生的,根據相對分子質量初步判斷m/z 162的中性片段為葡萄糖基,[M-H-162]-(m/z 301)為槲皮素,與文獻一致[17]。

圖3 化合物ⅡESI-MS圖及結構Fig.3 Compound Ⅱ ESI-MS diagram and structure

由圖4可知,在負離子模式下,準分子離子峰[M-H]-(m/z 463)可知該化合物的相對分子質量為464,碎片離子峰(m/z 301)是由準分子離子峰[M-H]-(m/z 463)丟失一個中性片段m/z 162產生的,根據相對分子量初步判斷該中性片段m/z 162為葡萄糖基的中性片段,碎片離子峰(m/z 271)可能是由碎片離子峰(m/z 301)裂解一個羥基產生的4′,5,7-三羥基黃酮,證明碎片離子峰(m/z 301)為槲皮素,與文獻一致[18]。

圖4 化合物ⅢESI-MS圖及結構Fig.4 Compound Ⅲ ESI-MS diagram and structure

由圖5可知,在負離子模式下,準分子離子峰[M-H]-(m/z 447)可知該化合物的相對分子質量為448,碎片離子峰[M-H-162]-(m/z 285)是由準分子離子峰失去一個m/z 162的中性片段產生的,根據相對分子質量初步判斷m/z 162的中性片段為吡喃葡萄糖基,[M-H-162]-(m/z 285)為山奈酚,與文獻一致[19]。

圖5 化合物Ⅳ ESI-MS圖及結構Fig.5 Compound Ⅳ ESI-MS diagram and structure

2.4 化合物結構解析

化合物1黃色粉末(甲醇);mp.176～178 ℃,ESI-MS m/z:609[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.42(1H,d,J=1.8Hz,H-8),6.83(1H,d,J=8.5Hz,H-5′),7.54(1H,d,J=2.0 Hz,H-6′),5.22(1H,d,J=6.9Hz,葡萄糖的端基氫),4.31(1H,鼠李糖的端基氫),1.06(3H,鼠李糖的甲基氫);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:157.0(C-2),133.3(C-3),177.9(C-4),161.0(C-5),98.6(C-6),165.2(C-7),93.3(C-8),156.3(C-9),104.2(C-10),121.2(C-1′),115.3(C-2′),144.8(C-3′),148.2(C-4′),115.3(C-5′),121.4(C-6′),101.2(C-1″),74.5(C-2″),76.9(C-3″),70.1(C-4″),75.0(C-5″),66.4(C-6″),101.8(C-1?),70.2(C-2?),69.9(C-3?),71.8(C-4?),68.3(C-5?),17.7(C-6?)。該數據與文獻[20-21]一致確定為蘆丁。

化合物2黃色針狀結晶(甲醇);mp.225～227 ℃;ESI-MS m/z:463[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.60(1H,s,5-OH),6.17(1 H,d,J=1.2Hz,H-6),6.38(1H,d,J=1.2Hz,H-8),7.49(1H,d,J=1.2Hz,H-2′),6.82(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),7.58(1H,dd,J=1.8,7.8Hz,H-6′),5.47(1H,d,J=7.3H z,H-1″),3.07～3.63(6H,m,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″,H-6′,);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.9(C-2),133.7(C-3),177.7(C-4),161.5(C-5),99.6(C-6),164.1(C-7),94.0(C-8),156. 4(C-9),104.3(C-10),122.0(C-1′),115.6(C-2′),145.3(C-3′),149.1(C-4′),116.6(C-5′),121.5(C-6′),101.2(C-1″),74.5(C-2″),76.9(C-3″),70.1(C-4″),78.0(C-5″),61.4(C-6″)。該數據與文獻[22-24]一致,確定化合物2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

化合物3淡黃色針狀結晶(甲醇);mp.227～229 ℃;ESI-MS m/z:463[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.61(1H,s,5-OH),6.17(1 H,d,J=1.2Hz,H-6),6.38(1H,d,J=1.2Hz,H-8),7.52(1H,d,J=1.8Hz,H-2′),6.80(1H,d,J=7.8 Hz,H-5′),7.65(1H,dd,J=1.8,7.8Hz,H-6′),5.38(1H,d,J=7.2H z,H-1″);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.5(C-2),133.8(C-3),177.7(C-4),161.6(C-5),102.6(C-6),165.2(C-7),94.0(C-8),156.74(C-9),104.3(C-10),121.99(C-1′),115.4(C-2′),145.3(C-3′),149.0(C-4′),116.3(C-5′),121.9(C-6′),99.2(C-1″),75.9(C-2″),73.9(C-3″),71.5(C-4″),68.3(C-5″),60.4(C-6″)。該數據與文獻[25-27]一致,確定化合物3為金絲桃苷。

化合物4黃色粉末(甲醇);mp.192～194 ℃;ESI-MS m/z:447[M-H]-1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:12.61(1H,s,OH),8.08(2H,d,J=8.9Hz,H-2,6),6.93(2H,d,J=8.9Hz,H-3,5),6.45(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.26(1H,d,J=2.9Hz,H-6),5.38(1H,d,J=7.4H z,H-1″);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:156.4(C-2),133.2(C-3),177.3(C-4),156.6(C-5),68.3(C-6),165.2(C-7),94.0(C-8),161.7(C-9),104.3(C-10),121.6(C-1′),130.8(C-2′),115.4(C-3′),160.0(C-4′),115.3(C-5′),130.9(C-6′),102.2(C-1″),73.9(C-2″),77.6(C-3″),71.0(C-4″),76.3(C-5″),60.8(C-6″)。該數據與文獻[28-29]一致,確定化合物4為山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3 討論

在測定單體化合物純度時,選擇等度洗脫,這樣可以節省時間和溶劑,要在紫外吸收全波長范圍內觀察是否有其他雜質峰,因為在不同的吸收波長下一些雜質峰有最大吸收才能顯現出來,這樣才能確定分離得到的單體化合物是否是單一的化合物。

在高效液相-串聯質譜(HPLC-MS-MS)解析化合物的結構時,考察了正負離子模式下,待測成分的裂解情況發現負離子模式下,待測黃酮類化合物更易產生準分子離子峰,響應靈敏度相對較高,故選擇負離子模式檢測。可能是黃酮類化合物其分子中的羥基很容易形成穩定的氧負離子,所以在負離子模式檢測所得總離子流圖有較好的信噪比,故實驗最終選擇在負離子模式下進行。

4 結論

本研究通過對藥桑葉醇提物乙酸乙酯部分總黃酮的提取和分離,采用大孔樹脂AB-8、中壓柱色譜、高效液相、制備液相分離純化得到高純度的黃酮單體化合物,采用核磁共振(NMR)、高效液相-串聯質譜(HPLC-MS-MS)、鑒定其分子結構:化合物1為槲皮素-3-O-蕓香糖苷(Rutinum)、化合物2為槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Isoquercitrin)、化合物3為金絲桃苷(Hyperin)、化合物4為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(kaempferol-1-3-O-β-D-glucopyranoside)。其中化合物3、4首次從新疆藥桑葉中分離得到。本研究對藥桑葉中乙酸乙酯相黃酮進行分離鑒定,旨在為進一步有效利用這一寶貴的天然植物資源提供理論依據,也為藥桑葉的綜合利用和深入研究提供理論基礎,為開發藥桑葉中的黃酮奠定物質基礎。

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Isolation and Identification of flavonoids compounds from XinjiangMorusnigraL.

ZHANG Gui-hui,WANG He,HE Chun-qiu,YANG Ling*

(1.College of Life Science,Tarim University,Alar 843300,China;2.Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,Xinjiang Production& Construction Corps,Alar 843300,China)

Flavonoids were isolated from ethyl acetate extract of alcohol extract ofMorusnigraL.by means of various chromatographic techniques.And they were identified by nuclear magnetic resonance(NMR)and HPLC-MS-MS. Four flavonoids were isolated and identified as Rutinum(1),Isoquercitrin(2),Hyperin(3)and kaempferol-1-3-O-β-D-glucopyranoside(4),respectively. Compou-nds(3)and(4)were isolated fromMorusnigraL. for the first time.

MorusnigraL.;flavonoids;structure identification;isoquercitrin;hyperin

2016-05-06

張貴會(1986-)，男，在讀碩士研究生，主要從事天然產物分子結構與功能方面的研究，E-mail:1144696239@qq.com。

*通訊作者:楊玲(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事天然產物分子結構與功能方面的研究，E-mail：yang ling zj @sina.com。

國家自然科學基金(31460080)資助。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000