響應面法優化青箱子總皂苷提取工藝

徐　霞　張　洪　李　晨　張　敏　劉　芳*?

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響應面法優化青箱子總皂苷提取工藝

徐霞張洪李晨張敏劉芳*?

（湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南 永州 425199）

文章通過響應面分析法，對溶劑法提取青箱子中的總皂苷工藝進行研究。實驗結果表明，顯著性影響因素排序為：提取溫度>提取時間>料液比；在提取溫度90oC、提取時間為2 h、料液比為1: 25的條件下，青箱子總皂苷提取率可高達0.86 %。

響應面法；青箱子；總皂苷；提取工藝

1　引　言

青葙子是莧科植物，一般生長在我國大部分地區的平原、田邊、丘陵以及山坡[1]。常以煎煮法與其他藥材配伍入藥，是較為常用的藥材之一。在中醫的理論中，青葙子味苦，性微寒，歸肝經，具有清肝瀉火，明目退翳的功效。主治視力模糊、目赤腫痛、目生翳膜和肝火眩暈[2]。在現代藥理學研究中，青箱子還具有護肝[3]、抗腫瘤[4]、抗糖尿病[5]等功效。此外，青箱子的水提液不僅可以提高晶狀體的抗氧化能力，還可以預防晶狀體上皮細胞的凋亡等[6,7]。

響應面法具有試驗次數少、精確度高、能研究幾種因素間交互作用[8]，所得信息量大且直觀。所采用的是非線性預測模型擬合，在中心點進行重復試驗以提高精確度[9-13]。本實驗通過加熱回流提取法提取其中有效成分青葙總皂苷，然后通過單因素優化法和響應面分析法來優化青葙總皂苷的提取工藝，使青葙子這一傳統的中藥材能更好地在現代醫療市場中發揮作用。

2　實驗部分

2.1實驗儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）、電熱鼓風干燥機（上海一恒科學儀器有限公司）、高效液相色譜CBM-20A型（島津企業管理（中國）有限公司）、中藥材粉碎機FW135、177型（天津市泰斯特儀器有限公司）、循環水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）型（鞏義市予華儀器有限公司）、電子天平IA3003型（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

2.2實驗試劑

青葙子（市售藥材）、60%乙醇、蒸餾水、青葙總皂苷標準品（上海伊卡生物技術有限公司）、乙腈（高效液相色譜用溶劑，上海陸都化學試劑廠）、0.1%冰乙酸水溶液。

2.3方法

（1）青葙子材料的預處理。干燥青葙子藥材200 g，粉碎，在干燥且處于室溫的條件下保存。

（2）青葙總皂苷的提取。精確稱取青葙子5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，按1:20的料液比（即加入100 mL 60%乙醇），然后組裝好加熱回流提取裝置，提取的時間為1 h，提取溫度為80oC，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。

（3）青葙總皂苷的含量測定（高效液相色譜法）。標準曲線繪制：取青箱總皂苷標準品適量,置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容。分別配置成濃度0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液。用0.45 μm濾膜過濾，作為標準品溶液備用。

液相色譜條件：檢測器：紫外檢測器（UV）；檢測波長：203 nm；流動相：乙腈-0.1 %冰醋酸水溶液（32:68）；柱溫：30oC；色譜時間：20 min；流速：1.0 mL/min。

分別精密吸取以上各種濃度的標準品溶液各10L，按編號依次進樣，通過測得的數據來繪制標準曲線，測得的標準曲線的方程為y=13175x－3336.8（R2=0.9991），如圖1所示。

總皂苷濃度(mg·mL-1)

圖1.青葙子總皂苷標準曲線

（4）青葙總皂苷含量的測定。分別精密吸取各組供試品溶液10L，按編號依次進樣，通過繪制的標準曲線來計算青葙總皂苷的收率。收率的計算公式為：收率（%）=供試品溶液的溶度×供試品溶液的體積÷原料的質量×100%。

3　實驗結果與討論

3.1單因素實驗

總皂苷的化學性質不是特別穩定，依據不穩定的化學性質選定總皂苷三個影響因素及提取時間、提取溫度、料液比，探究其對總皂苷得率的影響。

（1）提取時間單因素實驗。固定料液比為1:20，提取溫度80oC，提取2次，分別把每次提取的時間設為0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中。記錄時間對青葙總皂苷提取率的影響。實驗結果如表1所示。

由表1表明，隨著加熱時間的增加，總皂苷的收率在2.0 h前增加顯著，在2.0 h后收率緩慢減少。由于總皂苷的化學性質不是特別穩定，所以加熱時間過長，會導致總皂苷收率減少。

表1.時間單因素實驗結果

試驗編號123456 時間（h）0.501.002.003.004.005.00 收率（%）0.250.250.820.670.600.58

（2）提取溫度單因素實驗。固定料液比為1:20，提取2次，每次提取時間0.5 h，分別在溫度為30oC、40oC、50oC、60oC、70oC、80oC、90oC、100oC條件下提取，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，實驗結果如表2所示。

由表 2表明，隨著實驗提取溫度的升高，在90oC前總皂苷的收率不斷增加，而在90oC后總皂苷的收率開始減少，因而選擇提取溫度為80oC ~90oC作為提取的較適溫度。

表2.溫度單因素實驗結果

試驗編號12345678 溫度（℃）30.040.050.060.070.080.090.0100 收率（%）0.270.360.510.630.680.790.860.75

（3）料液比單因素實驗。固定提取溫度70oC，提取2次，每次提取時間0.5 h，料液比分別采取1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40的料液比進行提取，趁熱抽濾，合并濾液，將所得濾液裝載于離心管中，在4000 r/min的速度下離心10 min，取上清液置于25 mL容量瓶中，結果見表3。

由表3表明，隨著料液比的增加，總皂苷的收率在1: 25前緩慢增加，在1: 25后收率反而緩慢下降，所以料液比在1:25左右收率較高。

表3.料液比單因素實驗結果

試驗編號1234567 料液比1:101:151:201:251:301:351:40 收率（%）0.610.660.680.840.800.760.72

表4.響應面分析因素與水平

水平 時間A/ h 溫度B/ ℃ 料液比C/ g·mL-1 -18011:20 09021:25 110031:30

3.2 響應面分析法實驗設計

響應面法實驗：根據Box Benhnken的中心組合實驗設計原理[14],綜合上述實驗對總皂苷提取率的影響結果選取溫度、時間和料液比這三個因素，由單因素實驗設計響應面分析實驗為3因素3水平的實驗方案。響應面分析因素與水平見表4。響應面分析結果見表5。

表5.響應面分析結果

序號ABC收率 1-1-100.13 2-1100.59 31-100.53 41100.84 50-1-10.27 60-110.45 701-10.69 80110.80 9-10-10.37 1010-10.71 11-1010.64 121010.95 130001.01 140001.05 150000.96 160000.93 170000.97

對提取溫度、提取時間、料液比作如下轉換：A=（t-90）/10 ,B=（T-2）/1 , C=（2-30）/5 ，響應值（Y）是以三次實驗所取得的總皂苷收率的平均值，響應面分析結果如表5所示。析因實驗是1~12組實驗，中心實驗是13~15組實驗，從而估計實驗誤差，實驗分析結果如圖 2~圖 4所示。使用統計分析軟件Design-expert進行數據處理分析，回歸分析結果如表 6所示。因子經回歸擬合，解得回歸方為：Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2。表 6結果顯示決定系數R2=0.9146，則模型的擬合度很好。根據F的檢驗可知，概率P（F>Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高。表6結果表明，三種影響因素的一次項二次項都是高度顯著，則說明各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。綜上述分析，三種影響因素的排序為提取溫度>提取時間>料液比。

圖2-圖4是因素交互作用的響應面和等高線。圖3表明，A的水平變化等高線數目比B的數目多，說明提取時間對總皂苷的收率影響不顯著。由圖3所示，當提取時間和溫度不變時，隨著料液比的增加收率呈現先增加后減少的趨勢。原因是隨著料液比的增加，溶液的黏度會緩慢降低，對總皂苷的溶出有利。若是料液比過大，會使總皂苷含量降低。由圖2-圖4可知，3個響應面開口均為向下的凸型曲線，青箱子總皂苷收率存在極大值，說明提取的最優條件存在于所設計的因素水平范圍之中。

表6.青葙總皂苷提取回歸分析結果

方差來源自由度平方和均方F值P（F>Fα）顯著性 A10.210.21100.12< 0.0001高度顯著 B10.300.30140.50< 0.0001高度顯著 C10.0800.08037.910.0005高度顯著 AB15.625E-0035.625E-0032.670.1465不顯著 BC12.250E-0042.250E-0040.110.7536不顯著 AC11.225E-0031.225E-0030.580.4710不顯著 A210.130.1359.900.0001高度顯著 B210.350.35165.80< 0.0001高度顯著 C210.0860.08640.950.0004高度顯著 回 歸91.220.1464.00< 0.0001高度顯著 誤 差70.0152.110E-003 失擬項30.0370.0125.700.063 純誤差48.720 E-0032.180 E-003 總 和161.23 R2=0.9146

圖2.提取時間與提取溫度對總皂苷收率影響的響應面與等值線

圖3.提取溫度與料液比對總皂苷收率影響的響應面與等值線

圖4.提取時間與料液比對總皂苷收率影響的響應面與等值線

3.3 工藝條件優化及驗證實驗

在回歸方程Y=0.98+0.13A+0.16B+0.16C-0.038AB-0.017AC-0.0075BC-0.29A2-0.17B2-0.14C2中所示，二次項系數均為負數。使用Design Expert 軟件對工藝條件優化，在模型取值范圍內選擇最低點為起點，根據模型使用快速上升法進行優化，結果表明提取時間為2.1 h、提取溫度為90.3oC、料液比為1: 25.35且理論預測提取率為0.88 %。

為檢驗實驗結果是否與真實情況相一致，考慮到實際操作的便利，將條件修正為室溫條件下，提取時間為2 h、提取溫度溫度為90oC、料液比為1:25。在該條件下進行三次平行試驗，青箱子總皂苷的平均提取率為0.86 %，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.84 %，重復性很好，說明優化結果可靠。

4　結　論

由響應面實驗的分析結果，得到提取溫度是青箱子總皂苷的最佳控制點，由優化條件進行驗證實驗，在提取溫度90oC、提取時間為2 h、料液比為1:25的條件下，青箱子總皂苷提取率可高達0.86%。本實驗通過簡單易行的操作方法將總皂苷成分提取出來，為以后的研究提供一定的參考。

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（責任編校：宮彥軍）

2016－06－20

湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（湘教通[2015]269號472）。

徐霞（1993－），女，吉林蛟河人，湖南科技學院化學與生物工程學院制藥工程系學生。

劉芳(1972－)，女，湖南衡山縣人，湖南科技學院副教授，研究方向為天然有機。

R284.2

A

1673-2219（2016）10-0063-04