芝麻青枯雷爾氏菌生化特性及致病力分化的研究

李信申,肖運萍,魏林根,黃瑞榮,華菊玲*

(1.江西省農業科學院 植物保護研究所,江西 南昌 330200;2.江西省農業科學院 資源與環境研究所,江西 南昌 330200)

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芝麻青枯雷爾氏菌生化特性及致病力分化的研究

李信申1,肖運萍2,魏林根2,黃瑞榮1,華菊玲1*

(1.江西省農業科學院 植物保護研究所,江西 南昌 330200;2.江西省農業科學院 資源與環境研究所,江西 南昌 330200)

將采自江西12個縣(市)的芝麻青枯雷爾氏菌29株菌株分別人工接種到寄主植物番茄、茄子、馬鈴薯和煙草上，鑒定結果表明：全部菌株屬于生理小種1；25株菌株屬生化變種Ⅲ,3株屬生化變種Ⅳ,1株為生化變種Ⅲ-1亞種。對致病力測定結果的聚類分析表明：來自進賢、都昌、南昌、樟樹4個紅壤旱地傳統種植區的菌株致病力最強;來自鄱陽砂壤及潮洲地傳統種植區的菌株致病力中等；來自其它6個區域的菌株致病力最弱。因此，江西芝麻青枯雷爾氏菌的致病力存在明顯的分化現象,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生態是影響青枯雷爾氏菌致病力分化的重要因子。

芝麻;青枯雷爾氏菌;生理小種;生化變種;致病力分化

芝麻青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種土傳病害,系我國南方芝麻生產的重要限制因子[1]?，F有的全基因組測序研究結果表明,青枯雷爾氏菌的基因組由染色體(chromosome)和大質粒(megaplasmid)2個閉合環狀復制子構成[2-3]。大質粒上除包含一些重要持家基因副本外,還攜帶了為數眾多的菌株特有基因(strain-specific gene)和有助于提高病菌致病及適應能力的基因簇或遺傳島,如III型和VI型分泌系統、胞外多糖合成、鞭毛合成的基因簇等[2，4]。在分子進化過程中,青枯雷爾氏菌的染色體相對保守,而大質粒則更為活躍,其可變基因(variable gene)所占的比例高達63%[5]。青枯雷爾氏菌的這一遺傳特性,使得其致病力及生化特性呈現豐富的多樣性。研究青枯雷爾氏菌的生化特性和致病力分化可為作物抗病品種選育和病害的流行預測奠定基礎。潘哲超等[6]、鄧正平等[7]、何云昆等[8]、謝世勇等[9]、徐麗慧等[10]、呂志強等[11]、何自福等[12]先后研究了煙草、花生、桑及茄科作物青枯雷爾氏菌的生化特性和致病力分化,但目前尚未見芝麻青枯雷爾氏菌生化特性及致病力分化的研究報道。為此,筆者對江西芝麻青枯雷爾氏菌的生理小種、生化變種以及致病力分化進行了系統研究,以期為芝麻抗病資源篩選、抗病育種及病害防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試青枯雷爾氏菌菌株30株,其中來自江西省進賢、豐城、都昌、樟樹、鄱陽五個芝麻主產縣(市)的芝麻青枯病菌株有15株,來自其它7個縣(區)的芝麻青枯病菌株有14株(表1)。R.solanacearum的標準菌株GMI 1000(生理小種1，分離自番茄)由福建省農業科學院農業生物資源研究所提供。

1.2 生理小種的鑒定

鑒別寄主植物為番茄(早豐)、茄子(長虹茄子)、馬鈴薯(市售)和煙草(本生煙)。將供試菌株配成1×108CFU/mL的菌懸液；對番茄、茄子和馬鈴薯進行針刺接種，病情嚴重度分級標準參照任欣正等[13]。煙草過敏反應試驗參照方中達[14]的方法進行。生理小種鑒定參照Hayward[15]和He[16]的劃分標準。

1.3 生化變種的鑒定

生化變種測定方法參考French等[17]。

1.4 致病力測定及數據處理

供試芝麻品種為感病品種“中芝13”。在芝麻初花期進行針刺接種,每個處理接種10株苗。從接種后第7天開始,參照江西省地方標準DB36/T 879─2015分級標準進行病情調查,每隔10 d調查1次；在芝麻盛花后期各處理的病情基本穩定時,統計各處理的病情指數。采用卡方距離法計算各處理間的相似系數,用離差平方和法進行聚類分析[18 ]。

表1 供試芝麻青枯雷爾氏菌的來源

2 結果與分析

2.1 菌株的生理小種

針刺接種鑒定結果(表2)顯示,29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株與對照菌株GMI 1000均能侵染番茄、茄子和馬鈴薯這3種寄主植物。注射接種結果表明,上述分離菌株與對照菌株均可在煙葉上產生典型的深褐色壞死斑。根據Hayward和He的生理小種劃分標準,這些菌株均屬于生理小種1。

2.2 菌株的生化變種

29株供試菌株對三糖(乳糖、麥芽糖、纖維二糖)和三醇(甜醇、甘露醇、山梨醇)的碳源利用測定結果(表3)表明：Jsjx02、JSjx23、JSzs01等25株菌株對供試的6種碳源均呈陽性反應,屬生化變種Ⅲ,占86.21%;JSjx11、JSzs19、JSnc05這3株菌株對3種糖呈陰性反應,屬生化變種Ⅳ,占10.34%;菌株JSfy01僅對山梨醇呈陰性反應,定為生化變種Ⅲ-1亞種,占3.45%。

2.3 菌株的致病力分化

針刺接種試驗結果表明,供試的29株青枯雷爾氏菌菌株均對芝麻具有致病力,但致病力強弱存在明顯差異(表4)。聚類分析結果(圖1)顯示,上述29株菌株可聚類為3個組,第Ⅰ組共有13株菌株,來自進賢、南昌、豐城、樟樹、都昌的菌株均聚在該組中。該組還可再分為2個亞組,A亞組7株菌株的致病力最強,其中來自進賢3株，豐城2株，樟樹和南昌各1株;B亞組6株菌株的致病力次強,其中來自樟樹和都昌各2株，豐城和南昌各1株。第Ⅱ組共有16株菌株。該組可再分為3個亞組,C亞組4株菌株的致病力中等,來自鄱陽3株,都昌1株;D亞組和E亞組分別有8株和4株菌株,這兩個亞組的菌株的致病力均較弱,來自余干、分宜、九江等6個縣(區)的菌株均聚類在這兩個亞組中。

表2 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株生理小種鑒定結果

注：表中數據為病情嚴重度級別;“+”表示煙草過敏反應產生褐色壞死斑。

表3 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株生化變種鑒定結果

注：“+”表示陽性反應;“-”表示陰性反應。

表4 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株致病力測定結果

3 討論

不同地理起源的青枯雷爾氏菌在與其寄主長期協同進化的過程中,演化出明顯的生理分化和遺傳多樣性。根據其致病范圍,可分為5個生理小種(race 1～5)。其中,寄主范圍廣泛的生理小種1是我國長江流域及其以南地區的優勢菌系[19 ]。本研究對來自江西12個縣(市)不同土壤類型、不同栽培季節及不同芝麻品種上的29株代表性菌株的生理小種鑒定結果證實了這一點。29株菌株的生化變種鑒定結果顯示,生化變種Ⅲ菌群是誘發江西芝麻青枯病流行的優勢種群,也是芝麻青枯病流行結構的主要組成部分。現有研究揭示,青枯雷爾氏菌生理小種1、生化變種Ⅲ可侵染茄子、花生、馬鈴薯、番茄、煙草等多種作物,因此,選擇與非寄主作物進行合理輪作對芝麻及其它寄主作物青枯病的有效防控極為關鍵。

圖1 29株芝麻青枯雷爾氏菌菌株 致病力測定結果的聚類分析

本研究測定了不同縣(市)青枯雷爾氏菌對芝麻的致病力,結果表明,來自進賢、南昌、豐城、樟樹四個縣(市)的所有菌株以及來自都昌的2株菌株的致病力明顯強于來自芝麻主產區之一的鄱陽及其它區域菌株的。影響青枯雷爾氏菌致病力分化的外在因子主要有寄主植物種類、品種抗性水平、土壤生態及耕作栽培制度(尤其是前茬作物) 等。進賢、豐城、都昌均屬芝麻主產區,南昌縣菌株采集地亦為芝麻傳統種植區,這些區域多為排水不良的紅壤旱地,且生產上芝麻大多與花生、番茄、茄子、馬鈴薯等青枯雷爾氏菌寄主作物輪作,這些因素必然對青枯雷爾氏菌的致病力分化產生定向誘導作用,導致強致病力菌株成為優勢種群,從而致使這些區域芝麻青枯病連年嚴重發生。鄱陽雖亦屬傳統芝麻產區,但該區域大多為排水良好的砂壤地及潮洲地,且該區域為傳統棉花產區,所以其菌株的致病力受到寄主植物及土壤生態的影響較小,因而菌株的致病力相對較低。在余干、分宜、九江等6個縣(區),由于青枯雷爾氏菌菌株的致病力受到寄主植物及栽培制度的影響小,因而它們的致病力最弱。因此,從本研究結果可以得出:青枯雷爾氏菌與其寄主植物在長期互作中,寄主植物、耕作栽培制度和土壤生態是影響青枯雷爾氏菌致病力分化的主要外在因子。

青枯雷爾氏菌的致病力分化不僅與植物種類、品種抗性水平、土壤生態及耕作栽培制度等外在因素有關,更與其內在的致病基因、調控因子,以及與寄主抗病基因的互作密切相關。先后完成的9個青枯雷爾氏菌基因組全序列分析結果也表明,青枯雷爾氏菌在寄主植物的致病過程中,通過啟動復雜的全局調控網絡,協調各類分泌系統適時組裝以及各種毒性因子時序性表達和泌出,從而順利完成侵染循環[20 ]。參與青枯病致病過程的分泌系統包括:Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型及雙精氨酸轉運分泌系統;致病因子主要包括脂多糖、胞外多糖、胞外蛋白以及Ⅲ型效應子等[21 ]。尤其是Ⅲ型分泌系統(T3SS)及其效應子(effector)是完成致病過程和參與寄主互作反應最為重要的決定因子[22 ]。因此,關于芝麻青枯雷爾氏菌的遺傳譜型與致病力分化之間的關系還有待于進一步研究。

[1] 華菊玲,劉光榮,黃勁松.連作對芝麻根際微生物群落的影響[J].生態學報,2012,32(9):2936-2942.

[2] Salanoubat M, Genin S, Artiguenave F, et al. Genome sequence of the plant pathogenRalstoniasolanacearum[J]. Nature, 2002, 415: 497-502.

[3] Remenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within theRalstoniasolanacearumspecies complex reveal significant evolutionary divergence [J]. BMC Genomics, 2010, 11: 379.

[4] Remenant B, de Ca Cambiaire J C, Cellier G, et al.Ralstoniasyzygii, the blood disease bacterium and some AsianR.solanacearumstrains form a single genomic species despite divergent lifestyles [J]. PLoS ONE, 2011, 6: e24356.

[5] Guidot A, Prior P, Schoenfeld J, et al. Genomic structure and phylogeny of the plant pathogenRalstoniasolanacearuminferred from gene distribution analysis [J]. Journal of Bacteriology, 2007, 189(2): 377-387.

[6] 潘哲超,徐進,顧鋼,等.福建及貴州等地煙草青枯菌系統發育分析[J].植物保護,2012,38(1):18-23.

[7] 鄧正平,匡傳富,周志成,等.湖南煙草青枯病菌生理小種測定[J].湖南農業大學學報：自然科學版,2004,30(1):47-49.

[8] 何云昆,越志堅,李云海,等.云南省馬鈴薯青枯菌生物型研究[J].西南農業學報,1999,12(4):78-81.

[9] 謝世勇,阮宏椿,杜宜新,等.福建省花生青枯病菌遺傳多態性分析[J].福建農業學報,2009,24(4):351-354.

[10] 徐慧麗,徐福壽,李芳,等.桑細菌性青枯病病原及生化型鑒定[J].植物保護學報,2007,34(2):141-146.

[11] 呂志強,王漢榮,周勤,等.浙江省桑樹青枯病生理小種及生化型的測定[J].浙江農業學報,2007,19(4):306-309.

[12] 何自福,虞皓,羅方芳.廣東茄科青枯菌致病力分化及其DNA多態性[J].植物病理學報,2003,33(5):415-420.

[13] 任欣正,韋剛,齊秋鎖,等.不同寄主植物青枯菌菌株的比較研究[J].植物病理學報,1981,11(4):1-8.

[14] 方中達.植病研究法[M].北京:中國農業出版社,1998：388-390.

[15] Hayward A C. Characteristics ofPseudomonassolancearum[J]. J Appl Bacterial, 1964, 27: 265-277.

[16] He L Y. Characteristics of strains ofPseudomonassolanacearumfrom China [J]. Plant Disease, 1983, 67: 1357-1361.

[17] French E R, Gutarra L, Aley P, et al. Culture media forPseudomonassolanacearumisolation, identification, and maintenance [J]. Fitopatologia, 1995, 30(3): 126-130.

[18] 唐啟義,馮明光.實用統計分析及其計算機處理平臺[M].北京:中國農業出版社,1997.

[19] 徐進,馮潔.植物青枯菌遺傳多樣性及致病基因組學研究[J].中國農業科學,2013,46(14):2902-2909.

[20] Chen L, Shirota M, Zhang Y, et al. Involvement of HLK effectors inRalstoniasolanacearumdisease development in tomato [J]. Journal of General Plant Pathology, 2014, 80: 79-88.

[21] Remenant B, Babujee L, Lajus A, et al. Sequencing of K60, type strain of the major plant pathogenRalstoniasolanacearum[J]. Journal of Bacteriology, 2012, 194(10): 2742-2743.

[22] Solé M, Popa C, Mith O, et al. Theawrgene family encodes a novel class ofRalstoniasolanacearumtype Ⅲ effectors displaying virulence and avirulence activities [J]. MolecularPlant-MicrobeInteractions, 2012, 25(7): 941-953.

[23] 劉海龍,黎妍妍,鄭露,等.番茄青枯病菌的分子鑒定及其生物學特性研究[J].南方農業學報,2015,46(3):415-420.

(責任編輯:黃榮華)

Study on Biochemical Characteristics and Pathogenicity Differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom Sesame

LI Xin-shen1, XIAO Yun-ping2, WEI Lin-gen2, HUANG Rui-rong1, HUA Ju-ling1*

(1. Plant Protection Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, 330200, China; 2. Soil and Fertilizer & Resource and Environment Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

A total of 29 strains ofRalstoniasolanacearumisolated from sesame in 12 counties (cities) of Jiangxi Province were artificially inoculated into the host plants tomato, eggplant, potato and tobacco, respectively, and the classification results indicated that: all strains belonged to the physiological race 1; among them, 25 strains, 3 strains and 1 strain belonged to biovar Ⅲ, biovar Ⅳ and biovar Ⅲ-1, respectively. The clustering analysis of pathogenicity test results showed that: the strains isolated from sesame planted in red-soil dryland of Jinxian, Duchang, Nanchang and Zhangshu possessed the strongest pathogenicity; the strains from sesame planted in sandy loam soil and tidal sandy soil of Poyang possessed a middle pathogenicity; while those from other 6 regions had the weakest pathogenicity. Therefore, the pathogenicity differentiation ofRalstoniasolanacearumfrom sesame in Jiangxi was obvious, and it was affected mainly by host plant, cropping system and soil ecology.

Sesame;Ralstoniasolanacearum; Physiological race; Biovar; Differentiation of pathogenicity

2016-10-18

國家自然科學基金項目(31360428);農業部公益性行業(農業)科研專項(201303015);江西省支撐計劃項目(20121BBF60015)。

李信申(1980─),男,安徽蚌埠人,博士,從事植物病理學研究。*通訊作者:華菊玲。

S435.653

A

1001-8581(2016)12-0061-05