一個水稻小熱休克蛋白基因的克隆和鑒定

項聰英 蔡年俊 李靜 羊健 陳劍平,* 張恒木,*

(1浙江師范大學 化學與生命科學學院， 浙江 金華 321004； 2 浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所， 杭州310021；*通訊聯系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

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一個水稻小熱休克蛋白基因的克隆和鑒定

項聰英1, 2蔡年俊1, 2李靜2羊健2陳劍平2,*張恒木2,*

(1浙江師范大學 化學與生命科學學院， 浙江 金華 321004；2浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所， 杭州310021；*通訊聯系人， E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

XIANG Congying, CAI Nianjun, LI Jing, et al. Cloning and characterization of a small heat shock protein (SHSP) gene in rice plant. Chin J Rice Sci, 2016, 30(6): 587-592.

小分子熱休克蛋白(SHSP)廣泛存在于各類生物體中且在生物發育和逆境響應過程中發揮重要作用。我們克隆了一個水稻小熱休克蛋白基因(OsSHSP17.6)，序列分析表明該基因編碼區為477 bp，可編碼一個含158 個氨基酸的多肽，分子量約17.6 kD。序列分析顯示該類SHSP在不同的植物中是保守的，在分類上隸屬于CI類。實時定量RT-PCR分析顯示熱激處理可顯著增強該基因的轉錄；Western blotting分析顯示該蛋白大小與預期一致，且其含量在熱激處理時大幅度增加。這些結果一致表明OsSHSP17.6可能參與了水稻熱應激反應，這為進一步鑒定OsSHSP17.6的功能提供了基礎。

小熱休克蛋白； 熱激處理； 表達模式

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)被認為是一類高度進化、結構保守的分子伴侶蛋白[1-2]，因其在高溫脅迫下被高水平誘導表達而得名。實際上，植物熱休克蛋白基因的表達受很多生物或非生物逆境的影響，除了受熱刺激誘導，還會受低溫、干旱、鹽堿以及重氮化合物、2，4-二硝基苯酚、水楊酸鹽等化學物質的影響[2]，同時還受到病毒、細菌、真菌等多種病原侵染的誘導[3-4]。

熱休克蛋白廣泛存在于各類細胞中，其分子量為10 kD～200 kD，其中小熱休克蛋白(small heat shock protein，SHSP)是一類分子量在15～30kD之間的蛋白[1]。SHSP是植物體內最為豐富的一類熱休克蛋白，被認為是植物抗逆過程中的第一條防線[5]，保護細胞免受諸多環境脅迫，如重金屬、干旱、冷凍、氧化脅迫等。最近也有少數報道顯示，SHSP參與生物逆境響應過程[4,6]。據統計，哺乳動物中含有4個SHSP，果蠅中有4個SHSP，細菌中有2個SHSP，而擬南芥中有19個[7]，很顯然，相比之下，植物SHSP明顯具有更為復雜的多樣性。根據進化樹分析，植物SHSP至少被分為14個亞類(subfamilies)，亞細胞定位預測顯示，這些SHSP可能定位于不同的細胞器，包括細胞質、細胞核、葉綠體、線粒體、內質網、過氧化物體[8]。SHSP在不同細胞器中定位至少在一定程度上反應了植物SHSP的功能差異和功能多樣性，但對于它們的功能特點至今仍然了解很少。本實驗室在研究水稻條紋病毒與水稻基因互作的過程中首次發現了植物病毒侵染可改變SHSP在細胞內的定位和分布模式[4]，進一步分析顯示水稻條紋病毒復制酶可特異性地與宿主水稻一個SHSP在細胞質中相互作用，表明植物SHSP參與了病毒與宿主之間的互作過程。為了進一步探索該基因的功能特性，本研究從日本晴水稻中克隆鑒定了該基因，并進一步通過qRT-PCR和Western blotting技術分析了其在熱激條件下的表達特點。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為日本晴。大腸桿菌(Eschrichiacoli)菌株DH5α購于北京全式金生物有限公司；pGEM-T Easy載體購自Promega公司；SDS-PAGE低分子量蛋白標準購自Invitrogen公司；T4DNA連接酶、BamHⅠ和NdeⅠ購自TaKaRa公司；高純度質粒小提試劑盒購自康為世紀公司；反轉錄所用的第一鏈 cDNA 合成試劑盒購自TOYOBO公司；熒光定量PCR所用的SYBR Green I PCR 試劑盒購自Invitrogen公司；引物由上海博尚生物技術有限公司合成。

1.2 水稻培養及其總RNA、總蛋白質提取

日本晴水稻幼苗在光照培養箱培養，培養條件為(26±2)℃，16 h光照/8 h黑暗，培養3周后在設定溫度下熱激2 h。熱激處理后，分別采集對照和處理的水稻葉片，用Trizol試劑(Invitrogen)參照商家說明提取水稻葉片總RNA；參照羊健等[9]方法提取植物總蛋白。

1.3 水稻cDNA合成

取1 μg總RNA作模板，以Oligo(dT)18作為逆轉引物，采用第一鏈cDNA 合成試劑盒(TOYOBO)參照商家說明配制好反應體系，反應總體積20 μL，然后在42℃條件下孵育2 h，合成好的cDNA，置于-20℃冰箱保存備用。

1.4 OsSHSP17.6基因擴增和克隆

根據數據庫中Os03G026700(編碼OsSHSP17.6的序列號)獲得的序列，使用DNAMAN軟件設計了一對引物，即pF1(5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′)和pR1(5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)。取上述cDNA 1 μL作為基因擴增的模板，分別取濃度為20 μmol/L的引物pF1和pR1各0.3 μL，其他按照PCR試劑盒說明配制總體積為25 μL的反應體系。先94℃下預變性3 min；然后94℃下 30 s， 60℃下 30 s，72℃下 1 min的條件下反應30個循環；最后72℃下延伸10 min，即獲得PCR擴增產物。

1.5 基因克隆和測序

擴增產物經2% 瓊脂糖凝膠電泳分離后，應用PCR產物切膠純化試劑盒(Promega公司)切膠回收預期大小的片段，回收純化的具體步驟參照商家說明。純化的產物連接至pGEM-T-Easy載體(Promega公司)，然后轉化大腸桿菌DH5α并涂于氨芐抗性的LB平板，37℃下培養16 h后，選取若干菌落進行菌落PCR和雙酶切驗證，將含預期大小插入片段的克隆送至杭州博尚公司進行測序。

1.6 序列分析

測序結果經DNAMAN Version 6軟件(Lynnon公司)組裝后，與NCBI數據庫中的序列比對。采用NCBI中保守結構域數據庫(Conserved Domain Database，CDD，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白質結構域分析。采用MEGA6[10]中Neighbor-Joining算法構建進化樹，其中bootstrap值設置為1000。利用swiss-model 分子建模服務系統(http://www.swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質三維結構預測[11]，并采用rasmol軟件(http://www.openRasmol.org)對模型結構進行分析。

1.7 實時定量PCR(real time Quantitative PCR，qRT-PCR)

根據測定的OsSHSP17.6基因序列，使用DNAMAN軟件設計了2對引物(pQF，5′-AAG TTC CTC CGC AGG TTC C-3′；pQR，5′-GAG CAC GCC GTT CTC CAT-3′)用于qPCR分析。每個qPCR含有10 μL 2×SYBR PCR master mix(購自TOYOBO公司)、10 μmol/L濃度的引物pQF和pQR各0.8 μL 、 0.5 μL cDNA，然后加ddH2O至20 μL， 反應置于Applied Biosystems公司7900定量PCR儀上進行，反應條件為95℃下先預變性3 min，接著95℃下15 s，60℃下20 s，72℃下30 s，循環40次；然后樣品從60℃加熱至95℃獲得擴增產物的熔解曲線。每個反應至少3個重復，以Actin基因作為內參[12]，通過2-ΔΔCT方法計算相對表達量[13]。

1.8 蛋白質印跡分析

總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后，通過電轉移法將蛋白質轉印到硝酸纖維素膜上，用OsSHSP17.6兔抗作為一抗，參照梁國棟[14]的方法進行蛋白質印跡分析，用eECL Western Blot Kit顯色。

2 結果與討論

2.1 基因克隆及序列分析

為了克隆該水稻基因，設計了1對引物(pF1：5′-ATG TCG CTG ATC CGC CGC AG-3′和pR1：5′- CTA GCC GGA GAT CTG GAT G-3′)以水稻總cDNA為模板進行了擴增，擴增產物長度約500 bp，與預期結果一致；回收純化擴增的預期片段并將其連接至pGEM-T Easy載體，然后轉化大腸桿菌經菌落PCR鑒定后利用通用引物T7、SP6進行雙向測序。測序結果表明，該基因的編碼區長度為477 bp，可編碼一個含158 個氨基酸的多肽，分子量約17.6 kD。

登錄號分別為：SiSHSP(XP004984667，谷子)、AtSHSP(EMT09347，粗山羊草)、BdSHSP(XP010228221，二穗短柄草)、ZmSHSP(ACG35098，玉米)、SbSHSP(KXG39718，高粱)。

Accession numbers: SiSHSP (XP004984667,Setariaitalica), AtSHSP (EMT09347,Aegilopstauschii), BdSHSP (XP010228221,Brachypodiumdistachyon), ZmSHSP (ACG35098,Zeamays), SbSHSP (KXG39718，Sorghumbicolor).

圖1 OsSHSP17.6序列同源性(A)及保守結構域(B)分析

Fig. 1. Sequence homology (A) and conserved domain (B) analyses of OsSHSP17.6.

利用BLASTp程序搜索NCBI數據庫，顯示該類蛋白在其他植物中也存在高度同源的類似蛋白，序列比對分析顯示其序列同源性高達84.28%～89.94%(圖1-A)，表示該蛋白在植物中是保守的。二級結構分析顯示該類蛋白至少含有2個α螺旋，10個β折疊；蛋白保守結構域分析顯示該蛋白近C-端區域(aa52-143)存在一個保守的個α-晶體蛋白結構域(α-crystallin domain，ACD)(圖1-B)，該結構域包含92個氨基酸殘基序列，類似的結構多存在于小熱休克蛋白(small heat shock proteins，SHSP)及其他具有分子伴侶的蛋白中[15]，表明該基因可能編碼一個水稻小熱休克蛋白，暫命名為OsSHSP17.6。

目前擬南芥SHSP研究得較多，分類已經明確[8]。為了確定本研究所克隆的熱休克蛋白OsSHSP17.6所屬類型，我們從數據庫中下載了擬南芥SHSP序列[8]，采用MEGA6軟件進行進化樹分析(圖2)， OsSHSP17.6恰好與擬南芥CI類SHSP位于一簇，表明本研究克隆的OsSHSP17.6應歸屬于CI類SHSP。

2.2 熱激對OsSHSP17.6轉錄水平的影響

前面的分析表明OsSHSP17.6是一個熱休克蛋白。為了檢測OsSHSP17.6的表達是否受高溫影響，我們將在(26±2)℃條件下培養3周的水稻苗分為2組，一組為對照組，繼續在(26±2)℃條件下培養；另一組為處理組，在(45±2)℃條件(其他條件不變)下熱激培養2 h，隨后提取2組水稻總RNA進行逆轉錄獲得cDNA，再利用實時定量PCR技術分析OsSHSP17.6轉錄水平的變化(圖3)。相對于(26±2)℃的條件，(45±2)℃的溫度條件使得OsSHSP17.6基因在轉錄水平上增加了約74倍，表明OsSHSP17.6基因具有熱激轉錄活性。

圖2 OsSHSP17.6與擬南芥中的小熱休克蛋白進化關系

Fig. 2. Phylogenetic relationship of OsSHSP17.6 with SHSPs from Arabidopsis thaliana.

圖3 實時定量PCR分析OsSHSP17.6基因轉錄水平

Fig. 3. Transcription level of OsSHSP17.6 by real-time quantitative PCR.

2.3 熱激對OsSHSP17.6蛋白質翻譯水平的影響

為了確定熱激后OsSHSP17.6在蛋白水平上的變化，我們又提取了上述對照組和熱激處理組的水稻總蛋白，并利用OsSHSP17.6兔抗進行Western blotting分析(圖4)。在熱激處理的水稻中可特異性地在17.6 kD處檢測到一條顯色較強的條帶，且分子量與OsSHSP17.6的預期大小一致；而對照組中在17.6 kD處則未檢測到相應的條帶，表明了該蛋白在翻譯水平也是顯著增加的，也表明熱激有利于OsSHSP17.6的積累，這與該基因轉錄水平在熱激處理時增強的結果一致；另一方面，我們還發現在約80 kD處也檢測到顯色較強的條帶，而且在對照和熱激處理樣品中均檢測到該條帶，但很顯然熱激處理樣品中該條帶更強，相比之下，對照樣品中該條帶則弱得多，表明該條帶蛋白也是熱誘導蛋白。從該條帶的特異性推測該條帶可能是OsSHSP17.6蛋白的寡聚體，已有報道顯示小熱休克蛋白通常作為分子伴侶蛋白在脅迫響應過程中起作用[1,2]，而且小熱休克蛋白在植物體內和SDS-PAGE時均可以寡聚體的形式存在[4,16,17]；該條帶蛋白的水平與OsSHSP17.6基因轉錄水平在熱激條件下都顯著提高，這種相關性看上去支持該蛋白是OsSHSP17.6蛋白的寡聚體形式。但由于在17.6 kD處未檢測到相應的條帶，尚不能排除該大分子量蛋白條帶是一種與OsSHSP17.6同源蛋白的可能性，因此，該大分子量蛋白尚待進一步鑒定以明確其本質。

M-蛋白標記; 第1泳道為對照組樣品; 第2泳道為熱激處理樣品。

M, Protein marker; Lane 1, Control sample; Lane 2, Sample treated with heat shock.

圖4 Western blot分析OsSHSP17.6蛋白的表達水平

Fig. 4. Translational level of OsSHSP17.6 by Western blotting.

[1] Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol, 2003, 42(4): 579-620.

[2] Wang W, Vinocur B, Shoseyov O, et al. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response.TrendsPlantSci, 2004, 9(5): 244-252.

[3] Fang X, Chen J, Dai L, et al. Proteomic dissection of plant responses to various pathogens.Proteomics, 2015, 15(9): 1525-1543.

[4] Li J, Xiang C Y, Yang J, et al. Interaction of HSP20 with a viral RdRp changes its sub-cellular localization and distribution pattern in plants.SciRep, 2015, 5: 14016.

[5] Sun W, van Montagu M, Verbruggen N. Small heat shock proteins and stress tolerance in plants.BiochimBiophysActa, 2002, 1577: 1-9.

[6] Maimbo M, Ohnishi K, Hikichi Y, et al. Induction of a Small Heat Shock Protein and its functional roles in Nicotiana plants in the defense response againstRalstoniasolanacearum.PlantPhysiol, 2007, 145: 1588-1599.

[7] Haslbeck M, Franzmann T, Weinfurtner D, et al. Some like it hot: The structure and function of small heat shock proteins.NatStructMolBiol, 2005, 12: 842-846.

[8] Scharf K D, Siddique M, Vierling E. The expanding family ofArabidopsisthalianasmall heat stress proteins and a new family of proteins containing alpha-crystallin domains (Acd proteins).CellStress&Chaperon, 2001, 6(3): 225-237.

[9] 羊健, 張恒木, 陳劍平, 等. 水稻黑條矮縮病毒p8蛋白的原核表達、抗血清制備及其特性. 植物保護學報, 2007, 34(3): 252-256.

Yang J, Zhang H M, Chen J P, et al. Prekaryotic expression antiserum preparation and some properties of p8 protein of rice black-streaked dwarf Fijivirus.ActaPhytophylSin, 2007, 34(3): 252-256. (in Chinese with English abstract)

[10]Lewis P O, Kumar S, Tamura K, et al. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0.MolBiol&Evol, 2013, 30(4): 2725-2729.

[11]Schwede T, Kopp J, Guex N, et al. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server.NucleicAcidsRes, 2003, 31(13): 3381-3385.

[12]Yang J, Zhang F, Li J, et al. Integrative analysis of the microRNAome and transcriptome illuminates the response of susceptible rice plants to rice stripe virus.PloSOne, 2015, 11(1): e0146946.

[13]Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.NatProt, 2008, 3: 1101-1108.

[14]梁國棟. 最新分子生物學實驗技術, 科學出版社, 北京, 2001.

Liang G D. The Newest Experimental Techniques of Molecular Biology, Beijing：Science Press, 2001. (in Chinese)

[15]Holt S E, Aisner D L, Baur J, et al. Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes.GenesDev, 1999, 13(7): 817-826.

[16]Suzuki T C, Krawitz D C, Vierling E. The chloroplast small heat-shock protein oligomer is not phosphorylated and does not dissociate during heat stress in vivo.PlantPhysiol, 1998, 116: 1151-1161.

[17]Waters E R. The evolution, function, structure, and expression of the plant sHSPs.JExpBot, 2013, 64: 391-403.

Cloning and Characterization of a Small Heat Shock Protein (SHSP) Gene in Rice Plant

XIANG Cong-ying1, 2, CAI Nian-jun1, 2, LI Jing2, YANG Jian2, CHEN Jian-ping2, *, ZHANG Heng-mu2, *

(1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China;2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Key Laboratory of Biotechnology in Plant Protection of MOA and Zhejiang Province, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;*Corresponding author, E-mail: jpchen2001@hzcnc.com, zhhengmu@tsinghua.org.cn)

Small heat shock proteins (SHSPs) exist widely in all kinds of creatures and play an important role in both development and stress responses. A gene encoding a SHSP (OsSHSP17.6) was cloned fromOryzasativaand the sequence assembly showed the encoding region of OsSHSP17.6 was 477 bp in length, encoding a polypeptide of 158 aa with a molecular weight of 17.6 kD. Sequence analysis showed that such kind of SHSPs was conserved in different plants and belonged to the cytosolic class I (CI). The transcriptional level of OsSHSP17.6 was significantly up-regulated by heat shock with qRT-PCR. The protein appeared to be accumulated up to higher level under the condition of heat shock in western blotting assays. Taken together, these findings consistently indicated that OsSHPS17.6 could be involved into the response to heat shock, which could contribute to understanding the function of OsSHSP17.6.

small heat shock protein (SHSP)； heat shock； expression pattern

2016-03-30； 修改稿收到日期: 2016-04-29。

浙江省自然科學基金資助項目(LQ14-C140003)。

Q785; S511.01

A

1001-7216(2016)06-0587-06

項聰英, 蔡年俊, 李靜, 等. 一個水稻小熱休克蛋白基因的克隆和鑒定. 中國水稻科學， 2016， 30(6)： 587-592.