基因工程T細胞的臨床研究進展*

高俊芳，李 峰，王麗萍，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

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基因工程T細胞的臨床研究進展*

高俊芳1)，李 峰2)，王麗萍1)，張 毅1,2,3)#

1)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

免疫治療；基因工程T細胞；TCR-T細胞；CAR-T細胞

盡管手術和放化療等傳統治療手段在腫瘤治療方面取得了很大進展，但在改善腫瘤患者預后和生存等方面仍不令人滿意。近年來，腫瘤免疫治療領域發展迅速，出現了多種效果良好的免疫治療藥物和技術[1-6]。免疫治療已經成為腫瘤綜合治療的重要手段，甚至在不久后有可能成為腫瘤治療的主要手段。在這些免疫治療新技術中，基因工程T細胞的發展尤為令人矚目[7]。多項臨床研究[8-11]顯示，基因工程T細胞能夠有效清除機體內惡性細胞，甚至能夠長期緩解病情。該文將介紹基因工程T細胞的臨床研究進展，并探討該領域在中國的發展。

1 基因工程T細胞的主要類型

目前，臨床研究中最重要的基因工程T細胞是T細胞受體(T cell receptor, TCR)改造的T細胞(TCR-T細胞)和嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)T細胞(CAR-T細胞)。TCR-T和CAR-T細胞均通過識別腫瘤抗原來殺傷腫瘤細胞，但是二者在受體結構和抗原識別方面存在很大差異。TCR-T細胞中僅轉導了TCR的α鏈與β鏈，轉導的TCR依賴細胞內CD3和CD28等分子傳導信號，最終激活T細胞[12]。TCR構建相對復雜，既需要考慮主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)類型，又需要對復雜的α鏈與β鏈亞型進行鑒定，最后才能獲得特異TCR序列。而CAR中不僅含有識別腫瘤抗原的單鏈抗體(single chain antibody fragment, scFv)序列，更重要的是含有胞內信號轉導結構[13]，因此，CAR能夠以非MHC依賴性的方式識別腫瘤細胞表面抗原，并直接激活T細胞。另外，CAR序列的構建相對容易，可變區僅是scFv，其他部分均是保守的已知序列。在CAR-T細胞研究方面，目前的熱點主要是測試不同信號分子組合對T細胞功能的影響。由于具有結構簡單、作用直接等優點，CAR-T細胞是當前的研究熱點，尤其在血液腫瘤方面，CAR-T細胞臨床研究的報道非常多，并且取得了令人滿意的效果。與CAR-T細胞相比，TCR-T細胞在治療靶向性以及實體瘤治療方面具有優勢。TCR-T和CAR-T細胞受體結構差異改編自文獻[14]，見圖1；二者在抗原識別方面的差異見表1。

圖1 TCR-T(左)和CAR-T(右)細胞受體結構的差異表1 TCR-T和CAR-T細胞在抗原識別方面的差異

細胞類型受體結構MHC依賴性抗原定位體內擴增TCR-T細胞含TCRα鏈和β鏈依賴細胞表面或細胞內抗原依賴于抗原遞呈細胞擴增CAR-T細胞含抗原特異性scFv以及CD3-CD28等信號分子功能結構非依賴細胞表面抗原存在信號轉導分子,自主復制

2 TCR-T細胞的臨床研究

TCR是表達于T細胞表面的異二聚體蛋白分子，能夠識別和結合特異抗原肽-MHC并介導免疫應答。通過基因工程技術，將識別腫瘤特異抗原-MHC的TCR轉導至體外擴增的T細胞中，就能夠產生大量具有腫瘤特異殺傷能力的TCR-T細胞。目前，TCR-T細胞的臨床研究主要在實體瘤治療中開展，在血液系統惡性腫瘤治療方面僅有少量研究報道[10,15]。其中，TCR-T細胞在多發性骨髓瘤治療中效果顯著，70%的患者(研究中共納入20位患者)完全緩解，1位患者疾病進展，其余患者或部分緩解或疾病穩定。下面就TCR-T細胞治療實體瘤的臨床研究進展作一簡單介紹。

TCR-T細胞臨床研究開始的標志是2006年的兩項關于治療轉移性黑色素瘤的臨床研究報道。其中，Duval等[16]利用黑色素瘤分化抗原MART-1特異性TCR-T細胞治療了15例患者，盡管僅有1例患者出現了部分緩解，但該報道證明TCR-T細胞對人體是安全的。隨后，Morgan等[17]采用MART-1特異性TCR-T細胞治療15例患者，發現體外擴增的TCR-T細胞能夠在患者體內長期存活(檢測時已達2個月)，甚至在2例患者中高水平持續了1 a之久，并且這2例患者出現了客觀緩解。此后，隨著TCR-T細胞研究的深入，科學家認識到TCR親和性與治療效果緊密相關。當使用高親和力TCR-T細胞時，患者緩解率大幅上升。Johnson等[18]使用MART-1高親和力TCR-T細胞對20例轉移性黑色素瘤患者進行了治療，客觀緩解率達到30%。另一個影響TCR-T細胞治療效果的重要因素是特異性抗原在腫瘤中的表達?？乖磉_越廣泛，則特異性TCR-T細胞治療效果越好。一個典型例子是癌睪抗原NY-ESO-1。NY-ESO-1在腫瘤中的表達十分普遍。Robbins等[11,19]觀察了NY-ESO-1特異性TCR-T細胞治療黑色素瘤和滑膜肉瘤的效果，結果顯示55%黑色素瘤患者及61%滑膜肉瘤患者獲得了臨床緩解，黑色素瘤患者的3 a及5 a生存率均達到33%，滑膜肉瘤患者的3 a及5 a生存率分別達到了38%和14%。由于TCR-T細胞需要共刺激信號才能活化增殖，因此，樹突狀細胞(dendritic cell,DC)能夠增強TCR-T細胞的治療效果。Chodon等[20]采用DC疫苗聯合MART-1特異性TCR-T細胞治療14例轉移性黑色素瘤患者，結果顯示高達69%的患者明顯好轉。

在TCR-T細胞治療的發展過程中，Steven Rosenberg做出了巨大貢獻。Steven Rosenberg是腫瘤免疫治療的代表人物，他的工作推動了包括腫瘤浸潤淋巴細胞、TCR-T細胞和CAR-T細胞在內的過繼性細胞治療的進步。特別是在TCR-T細胞治療領域，多數臨床研究報道來自Steven Rosenberg團隊。近期，Steven Rosenberg又引領了細胞治療領域的突破，他的團隊鑒定了識別腫瘤新抗原的CD4+T細胞，利用這些細胞治療后腫瘤明顯縮小[21]。這項研究突顯了新抗原在腫瘤治療中的重要性，奠定了新抗原作為基因工程T細胞治療靶點的研究基礎。更加值得注意的是，Steven Rosenberg創新了傳統TCR構建方案，使利用外周血T細胞構建腫瘤抗原特異性TCR成為現實[22]，這將進一步加速TCR-T細胞的研究進展。

3 CAR-T細胞的臨床研究

從CAR概念的提出，至今已經20余年。CAR結構從含單一信號分子到現在含有3個甚至更多信號調控分子。對CAR結構的改造成功提高了T細胞活性與體內存活時間，為CAR-T細胞的臨床應用奠定了良好基礎[3,23]。目前，該領域的研究進展集中在CD19特異性CAR-T細胞治療惡性血液病方面[8, 24-26]。CD19是一個良好的血液系統腫瘤治療靶點，表達于幾乎全部B細胞性惡性腫瘤上，但在正常細胞中，僅成熟B細胞、前體B細胞以及部分DC細胞表達CD19。更為重要的是造血干細胞不表達CD19，因而攻擊CD19靶點不會影響患者的正常造血功能。

在CAR-T細胞的發展中，Carl June是一位里程碑式人物，他的系統工作為CAR-T細胞治療突破鋪平了道路。Carl June團隊首先證實了利用病毒表達系統改造的CAR-T細胞在機體內能夠長期存活，并且攜帶異源基因的T細胞對機體無害[27]。Carl June團隊還觀察了CD19特異性CAR-T細胞在多種血液系統腫瘤中的治療效果。2011年，Carl June團隊報道了CD19特異性CAR-T細胞治療晚期慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的臨床研究結果[24-25]。輸入的CAR-T細胞能夠在患者體內長期存活并發揮功能，通過清除外周血和骨髓中的惡性細胞，幫助重建正常免疫系統，最終帶來病情的長期緩解(觀察時已經達到10個月)。隨后，Carl June團隊又報道了CD19特異性CAR-T細胞治療復發急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的臨床研究結果[9,26]。與CLL治療效果類似，CAR-T細胞同樣能夠在ALL患者體內長效清除惡性細胞，持續緩解病情(在部分患者中觀察到至少11個月的持續緩解)。更令人振奮的是，90%患者的病情在CAR-T細胞治療后完全緩解。此外，Carl June團隊還證實CAR-T細胞治療對難治性多發性骨髓瘤同樣有效[28]。除了Carl June團隊的工作外，還有多項研究[29-31]結果支持CAR-T細胞治療血液系統惡性腫瘤的有效性。Brentjens等[32]的工作也進一步證實CAR-T細胞在CLL和ALL治療中的有效性。而Kochenderfer等[33]則發現CAR-T細胞在淋巴瘤治療中也非常有效。除了CD19外，CD33也是血液系統腫瘤治療的靶點[34]，但相關報道較少，尚需更多研究來驗證CD33特異性CAR-T細胞治療的有效性。

與在血液系統腫瘤治療中取得的成就相比，CAR-T細胞治療實體瘤的臨床研究結果不是十分理想。2006年，Lamers等[35]觀察了靶向碳酸酐酶Ⅸ的CAR-T細胞治療轉移性腎細胞癌的效果。改造的CAR-T細胞可以在患者體內存活7周但沒有明顯的治療作用。這項研究作為CAR細胞治療實體瘤的先驅具有開拓性意義。之后的幾項臨床研究[36-37]也都證實CAR-T細胞能夠在實體瘤患者體內生存較長時間(最長達到192周)，且沒有明顯毒副作用，但是也未能顯著緩解病情。韓為東的團隊[38]觀察了靶向EGFR的CAR-T細胞治療EGFR陽性的復發或難治性非小細胞肺癌的效果，結果未出現嚴重毒副作用，且治療后EGFR轉陰，但臨床效果并不十分明顯。值得注意的是，Ahmed等[39]在難治性肉瘤患者中發現，經靜脈輸入的相當一部分CAR-T細胞能夠到達腫瘤病灶，并在腫瘤中擴增；與此觀察一致的是，腫瘤組織出現了大面積壞死，然而腫塊沒有明顯縮小，患者沒有顯著臨床反應。結合TCR-T細胞的臨床研究經驗，這個結果提示在面對異質性程度更高的實體瘤時，要采用針對不同靶點的基因工程T細胞(CAR-T細胞和TCR-T細胞)來聯合治療，同時要盡可能降低腫瘤負荷，這樣才能取得好的治療效果。

4 基因工程T細胞治療中存在的問題

基因工程T細胞展示出強大的腫瘤清除能力，但也存在很多問題，例如，生產成本高、T細胞基因轉導難和特異性細胞純度不一致等。其中，影響治療安全的因素主要是脫靶效應和細胞因子釋放綜合征(cytokine releasing syndrome,CRS)[8-9,40]。前者產生的原因是基因工程T細胞識別的抗原往往不是腫瘤細胞獨有的，部分正常組織也表達這些抗原，這就導致基因工程T細胞也會攻擊正常細胞。在TCR-T細胞治療研究中，曾發現脫靶效應會帶來嚴重腸炎和心臟毒性，并曾導致部分患者死亡[41-42]。而在CAR-T細胞治療研究中，最典型的例子是CD19特異性T細胞攻擊正常B細胞，使患者發生低丙種球蛋白血癥[43]。為了解決這一問題，科學家設計了分子開關來調節基因工程T細胞活性，希望將脫靶效應的影響降至最低。另外，針對腫瘤新抗原設計基因工程T細胞可能有助于更徹底地解決脫靶問題[44]。另外一個基因工程T細胞治療的主要副作用——CRS的產生主要是由于基因工程T細胞過于強大的腫瘤殺傷能力，使機體短時間內釋放大量促炎性因子，導致患者出現發熱、皮疹，器官衰竭，甚至死亡等[43，45]。但是隨著對基因工程T細胞作用機制的認識加深，通過控制細胞注射數量已經能夠很好地防止CRS的發生。相信隨著研究的進一步深入，CRS將不再是基因工程T細胞治療的限制因素。

5 中國科研人員的工作

近年來，中國科研人員在腫瘤免疫治療基礎研究方面也取得了許多成果[46-47]。在基因工程T細胞治療研究領域，中國科技人員開展了廣泛而深入的研究，并做出了相應貢獻。在CAR-T細胞領域，解放軍301醫院的韓為東教授做出了代表性工作，他的團隊觀察了針對不同抗原(CD19、CD20和CD33)的CAR-T細胞對白血病和淋巴瘤患者的治療效果[34,48-49]，拓寬了CAR-T細胞的應用范圍。更加令人欣喜的是，根據公開數據，半數以上注冊的CAR-T細胞臨床研究由中國科學家或公司主導，這說明中國在CAR-T細胞研究和治療方面已經處于世界前列。在TCR-T細胞方面，目前尚未見國內的相關臨床研究報道，但是根據ClinicalTrials.gov數據，中國境內已經開始了多項TCR-T細胞的臨床研究。作者所在的實驗室也開展了基因工程T細胞方面的工作：構建了針對血液系統腫瘤和實體瘤不同抗原的CAR-T細胞，并研究了這些細胞單獨或聯合治療的效果；利用誘導型自殺基因來提高基因工程T細胞治療的安全性，并在動物實驗中取得了較佳效果；構建了病毒相關腫瘤抗原與癌睪抗原高親和力TCR序列庫，臨床前研究顯示這些高親和力TCR在介導T細胞清除實體瘤時具有很好的效果，為基因工程T細胞的臨床研究打下了基礎。

6 展望

盡管基因工程T細胞治療還存在種種問題，但是我們更應該注意到該類治療的巨大潛力。據報道[50]CAR-T細胞治療晚期或者難治性白血病的完全緩解率達到94%。這個結果非常振奮人心，也進一步證明了基因工程T細胞的巨大潛力。隨著腫瘤免疫學和基因工程技術的進步，基因工程T細胞治療將更加個體化。目前，基因工程T細胞主要針對“通用靶點”進行治療，這就導致部分患者治療反應不佳或者無反應。但是，如果能夠根據患者的腫瘤特異新抗原設計個體化基因工程T細胞，同時與靶向腫瘤免疫微環境的免疫檢查點抑制劑等相結合，將極大地提高治療有效性和安全性?？偠灾?，基因工程T細胞將在腫瘤治療中發揮越來越重要的作用，它的發展將為腫瘤患者帶來更多希望。

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(2016-06-08收稿 責任編輯徐春燕)

特約述評作者簡介

張毅，教授、博士研究生導師、河南省特聘教授；鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心主任；河南省腫瘤免疫治療工程研究中心主任、河南省腫瘤免疫和生物治療重點實驗室主任；比利時魯汶大學腫瘤免疫學博士；國際細胞生物研究所和Ludwig癌癥研究所布魯塞爾分所博士后；美國芝加哥大學研究型助理教授、南卡醫科大學助理教授和腫瘤免疫研究室主任。主持過美國癌癥研究所、美國癌癥協會、美國NIH、國家自然科學基金面上和國際合作項目以及衛生部重點攻關等基金項目；發表論文160余篇，其中SCI論文72篇，被引用1 500余次。中國醫藥質量管理學會細胞治療質量管理和研究分會常務副主任委員、中國研究型醫院生物治療學分會副主任委員、中國醫藥生物技術協會精準醫療分會常委、河南省免疫學會和河南省抗癌學會生物治療專業委員會主任委員。

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.001

*國家自然科學基金項目 81171986,81271815；衛生部科研資助金 201501004