RNA干擾人永生化食管上皮惡變細胞中核干細胞因子對PI3K/AKT表達的影響*

胡夢竹，王 娟，王盼盼，張洪磊，張 霞，張 巧，高社干，張功員#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河北省人民醫院病案統計室 石家莊 050000 3)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州 450001 4)河南科技大學第一附屬醫院腫瘤內科 洛陽 471000

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RNA干擾人永生化食管上皮惡變細胞中核干細胞因子對PI3K/AKT表達的影響*

胡夢竹1)，王 娟2)，王盼盼1)，張洪磊1)，張 霞1)，張 巧3)，高社干4)，張功員1)#

1)鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)河北省人民醫院病案統計室 石家莊 050000 3)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州 450001 4)河南科技大學第一附屬醫院腫瘤內科 洛陽 471000

#通信作者，男，1965年7月生，博士，教授，研究方向：分子流行病學，E-mail：zgy@zzu.edu.cn

永生化食管上皮惡變細胞；核干細胞因子；RNA干擾；PI3K/AKT信號轉導通路

目的：研究抑制人永生化食管上皮惡變細胞(SHEEC)中核干細胞因子(NS)對PI3K/AKT信號轉導通路中相關分子表達的影響。方法：將干擾試劑(NS-RNAi)轉染至SHEEC中以抑制NS的表達，以SHEEC組、陰性對照組(NC組)和MOCK組為對照，采用RT-PCR和Western blot方法檢測干擾后PI3K/AKT通路中相關因子mRNA和蛋白表達水平的變化。結果：NS-RNAi成功轉染至SHEEC中。抑制SHEEC中NS的表達后PI3K和AKT mRNA的相對表達量為(0.460±0.207)和(0.492±0.233)，與SHEEC組、NC組和MOCK組比較,差異有統計學意義(P均<0.05)；干擾NS表達后PI3K 和AKT蛋白的相對表達量為(0.353±0.361)和(0.312±0.068)，與SHEEC組、NC組和MOCK組比較,差異有統計學意義(P均<0.05)。結論：抑制SHEEC中NS表達后PI3K/AKT信號通路中相關因子的表達均明顯下降，PI3K/AKT信號通路可能是NS發揮作用的一種非依賴P53作用的信號途徑。

核干細胞因子(nucleostemin,NS)最早于2002年由Tsai等[1]在中樞神經系統的干細胞、胚胎干細胞和一些腫瘤細胞的核仁中發現，它包含一個N-末端基本域和兩個GTP結合域，當干細胞開始分化時NS基因迅速減少直至消失。近年來研究[2]發現，NS在多種腫瘤細胞和組織高表達，與腫瘤細胞增殖及凋亡密切相關。 有研究[3-4]表明通過RNA干擾(RNAi)技術使NS基因沉默，能明顯抑制細胞增殖能力，使NS基因表達量下降，提示NS可能會成為食管癌的一個新的靶向治療基因。NS可能通過P53對細胞周期起作用[5]，它與P53結合可形成一個NS-P53蛋白復合物，從而使抑癌基因P53的功能受到抑制，細胞重新進入增殖周期[6]。但也有研究[7]發現，NS通過多條途徑影響細胞增殖和細胞周期進展，可能不僅僅只有P53參與，而存在其他非依賴P53的通路，但具體機制還不清楚。磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)信號轉導通路在多種腫瘤中表達失調,對腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲、轉移和凋亡起著關鍵作用[8]。人永生化食管上皮惡變細胞(Shantou human embryonic esophageal carcinoma epithelial cell,SHEEC)由沈忠英等[9]建株,它是用人乳頭狀瘤病毒18型E6E7基因感染人胚胎食管黏膜,培養傳代后加入促癌物誘導上皮惡性轉化,從而建立的人胚食管癌變模型。該研究以SHEEC為實驗材料，采用RT-PCR、Western blot方法檢測干擾SHEEC中NS基因的表達對PI3K/AKT通路中相關因子表達的影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SHEEC由河南科技大學第一附屬醫院高社干教授饋贈。新生牛血清購自美國Gibco公司，DMEM-F12培養基購自北京索萊寶科技有限公司，超純RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、總蛋白抽提試劑盒和ECL化學發光顯色試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司，AceQTMqPCR SYBR@ Green Master Mix購自南京諾唯贊公司，siRNA oligos由蘇州吉瑪生物有限公司設計并合成，兔單克隆PI3K P85 alpha抗體和兔多克隆AKT1 p-S473抗體購自美國Abcam 公司，辣根山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要實驗儀器有System Applied Biosystems 公司的7500 Fast RT-PCR儀、日本Nikon公司的熒光顯微鏡、上海Heal Force公司的HFsafe-1200超凈工作臺和細胞培養箱、美國Bio-Rad公司的熒光化學成像儀。

1.2 細胞培養 用含體積分數10%新生牛血清和支原體抗生素M-Plasmocin(5 mg/L)的DMEM-F12完全培養基，在體積分數5%CO2、37 ℃、95%濕度的恒溫培養箱中培養，1～2 d換液，2～3 d傳代。

1.3 細胞轉染干擾NS的表達 轉染前1 d進行細胞鋪板，細胞處于對數生長期時收集細胞并調整細胞密度為3.0×105mL-1的單細胞懸液，接種在6孔板上，每孔2 mL，24 h內細胞融合達到70%～90%。按RNAi說明書進行轉染，實驗分為5組：SHEEC組加正常培養基；陰性對照(NC)-FAM組加轉染試劑 Lipofectamin 2000、FAM熒光試劑和無血清培養基；NC組加 Lipofectamin 2000、NC-RNAi和無血清培養基；MOCK組加 Lipofectamin 2000和無血清培養基；NS-RNAi組加Lipofectamin 2000、NS-RNAi和無血清培養基。每組12個復孔。轉染6～8 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率，RT-PCR檢測24 h后mRNA的表達，Western blot檢測48 h后蛋白的表達。所用siRNA oligos由蘇州吉瑪生物有限公司設計并合成。NC組：上游5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；NC-FAM組：上游 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；NS-RNAi組：上游 5’-GGUCUGACAAAUGGAAUAATT-3’，下游5’-UUAUUCCAUUUGUCAGACCTT-3’。

1.4 RT-PCR檢測干擾NS表達后SHEEC中PI3K 和AKT mRNA的表達 細胞轉染24 h后提取各組細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA第一鏈，所得cDNA-20 ℃保存或用于RT-PCR。從GenBank上查找PI3K和AKT的基因序列，所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PI3K引物序列：上游5’-GCCACAACCACATA CAACACA-3’，下游5’-CCAGAGTCCCAACTTTCA GC-3’，擴增產物大小130 bp；AKT引物序列：上游5’-CAGGATGTGGACCAACGTGA-3’，下游5’-AAGGT GCGTTCGATGACAGT-3’，擴增產物大小137 bp；β-actin引物序列：上游5’-TGACGTGGACATCCG CAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，擴增產物大小200 bp。

參考試劑盒說明書進行 RT-PCR，配制20 μL的反應體系，采用兩步法進行反應[10]。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。繪制溶解曲線，采用2-ΔΔCt法分析各組目的基因的相對表達量。

1.5 Western blot檢測干擾NS表達后SHEEC中PI3K 和AKT 蛋白的表達 提取各組細胞的總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。按常規方法進行SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，封閉。加入PI3K一抗 (11 000)、AKT一抗(11 000)和內參β-actin一抗(18 000),4 ℃過夜，再加入山羊抗兔IgG二抗(110 000)，最后滴加ECL化學發光顯色試劑在熒光化學成像儀中顯影。采用Image Pro-Pus軟件對結果進行分析。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析。不同組間NS mRNA、PI3K和AKT mRNA及蛋白表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 siRNA干擾SHEEC中NS的表達 在熒光顯微鏡下觀察到細胞轉染效率較高(圖1)。RT-PCR檢測顯示，轉染后SHEEC中NS mRNA表達水平明顯下降(表1)。

A：普通顯微鏡；B：熒光顯微鏡。圖1 轉染6 h后的SHEEC(×100)表1 不同轉染組NS mRNA相對表達量比較

組別nNSmRNA相對表達量SHEEC組121.000±0.001NC組121.151±0.267MOCK組121.309±0.317NS-RNAi組120.522±0.159*

F=9.355,P=0.002;*：與SHEEC組、NC組和MOCK組相比，P<0.05。

2.2 干擾NS表達后SHEEC中PI3K和AKT mRNA的表達 結果見表2。

表2 干擾NS表達后SHEEC 中PI3K和AKT mRNA的相對表達量

*：與SHEEC組、NC組和MOCK組相比,P<0.05。

2.3 干擾NS表達后SHEEC中PI3K和AKT蛋白的表達 Western blot檢測結果顯示，抑制NS表達后SHEEC中PI3K和AKT 蛋白表達水平明顯下降(圖2、表3)。

M:Marker;1:NS-RNAi組;2:NC組;3:MOCK組;4:SHEEC組。圖2 抑制NS表達后 SHEEC中PI3K和AKT蛋白的表達表3 干擾NS表達后SHEEC中PI3K 和AKT 蛋白的表達

組別nPI3KAKTSHEEC組121.213±0.2271.201±0.523NC組121.031±0.3320.890±0.165MOCK組121.060±0.1870.959±0.135NS-RNAi組120.353±0.361*0.312±0.068*F13.19521.431P0.0150.006

*：與SHEEC組、NC組和MOCK組相比,P<0.05。

3 討論

NS集中在大多數干細胞的細胞核和腫瘤細胞中，可能是維持干細胞和癌細胞增殖所必需的，能使細胞保持在不分化的狀態[1]。人類NS基因定位于3p21.1，含549個氨基酸，是一個GTP結合蛋白，NS通過P53來調節細胞周期，沉默NS基因可以導致P53陽性細胞的細胞周期停滯在G1期。Dai等[11]研究還發現,NS的異位過表達和缺失都可以激活P53，并使細胞周期停滯，抑制細胞增殖。Liu等[12]研究發現,NS主要參與細胞周期和增殖分化的網絡，但是P53也許不是NS調節途徑的惟一通路，c-Myc也可以直接或間接地與它進行交互。但是有關NS基因的信號轉導通路的研究甚少，該研究選取PI3K/AKT信號通路，測定SHEEC中NS的下調對PI3K/AKT通路相關分子表達的影響。

PI3K/AKT信號轉導通路與細胞生長、增殖分化密切相關，在信號轉導通路中起重要作用，該通路的異常活化可以導致細胞的惡性轉化，并在腫瘤細胞的凋亡和血管生成、侵襲和轉移中起重要作用。該通路在多種腫瘤細胞中異常表達，秦小琪等[13]研究發現成年人各型急性白血病組和慢性粒細胞白血病組中PI3K和AKT mRNA表達量高于對照組，表明PI3K/AKT信號轉導通路在轉錄水平參與白血病的發生發展。盧紅等[14]研究發現，食管癌組織中p-AKT蛋白的表達水平高于癌旁正常黏膜組織，并與食管鱗癌的分化程度和分期有關。NS和PI3K/AKT信號通路都與腫瘤細胞的增殖分化、細胞周期以及凋亡有密切的關系，干擾NS的表達或者抑制PI3K/AKT信號轉導通路均可以抑制或降低腫瘤細胞的增殖能力，促進細胞凋亡[15-17]。該研究結果表明，沉默SHEEC中NS基因后，PI3K/AKT信號轉導通路中相關因子PI3K、AKT mRNA和蛋白的表達水平都出現了下調，推測NS基因被抑制后可能會對PI3K/AKT通路產生一定的影響，兩者可能存在著一定的關聯，但還需進一步的研究探索。

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(2016-01-08收稿 責任編輯姜春霞)

RNA interfering effect of nucleostemin on expression of PI3K/AKT in Shantou human embryonic esophageal carcinoma epithelial cells

HUMengzhu1),WANGJuan2),WANGPanpan1),ZHANGHonglei1),ZHANGXia1)，ZHANGQiao3),GAOShegan4),ZHANGGongyuan1)

1)DepartmentofEpidemiology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)MedicalRecordStatisticsRoom,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050000 3)DepartmentofHealthToxicology,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 4)DepartmentofMedicalOncology,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000

SHEEC;nucleostemin;RNA interfering;PI3K/AKT signaling pathway

Aim: To explore the effect of inhibiting nucleostemin(NS) on PI3K/AKT signal pathway in SHEEC. Methods: RNA interfering agents(NS-RNAi) was transfected into SHEEC to inhibit the expression of NS gene, with the SHEEC group, negative control(NC) group, and MOCK group as control, and the expressions of PI3K/AKT pathway related factors were detected by using RT-PCR and Western blot methods.Results: SHEEC was transfected by NS-RNAi and the transfection rate was high. The expression levels of PI3K and AKT mRNA[(0.460±0.207) and (0.492±0.233)] were obviously down-regulated by inhibiting NS gene in comparison with SHEEC, NC and MOCK groups(P<0.05). The expression levels of PI3K and AKT proteins were (0.353±0.361) and (0.312±0.068), and showed significant difference in comparison with SHEEC, NC and MOCK groups(P<0.05).Conclusion: The expressions of PI3K/AKT signal pathway related factors decrease with NS down-regulation in SHEEC, and the PI3K/AKT signal pathway may be a kind of NS P53-independent pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.004

*河南省基礎研究資助項目 132300410129；河南省教育廳科技攻關資助項目 13A330632

R735.1