氟暴露及雌激素受體α基因PvuⅡ多態(tài)性對(duì)成人血清鈣、鎂含量的影響*

張艷麗,朱靜媛,崔留欣,后加祥,周郭育,程學(xué)敏,巴 月

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

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氟暴露及雌激素受體α基因PvuⅡ多態(tài)性對(duì)成人血清鈣、鎂含量的影響*

張艷麗,朱靜媛,崔留欣,后加祥,周郭育,程學(xué)敏,巴 月#

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1963年7月生，博士，教授，研究方向：環(huán)境相關(guān)疾病分子發(fā)病機(jī)制，E-mail:byyue@zzu.edu.cn

氟；雌激素受體；基因多態(tài)性；鈣；鎂

目的：研究不同飲水氟暴露水平人群中雌激素受體(ER)α基因PvuⅡ多態(tài)性與血清鈣、鎂含量的關(guān)系。方法：采用整群抽樣的方法，在高氟區(qū)、改水區(qū)和對(duì)照區(qū)選擇當(dāng)?shù)爻錾蚓幼? a以上18～55歲人群為觀察對(duì)象，采用PCR-RFLP法檢測(cè)ERα PvuⅡ多態(tài)性，采用原子吸收分光光度法測(cè)定血清鈣、鎂含量，采用氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟含量。結(jié)果：改水組男性血清鈣、鎂含量和女性血清鎂含量均低于高氟組和對(duì)照組(P<0.05)；女性高氟組血清鈣含量高于對(duì)照組和改水組(P<0.05)。多重線性回歸結(jié)果顯示，尿氟水平是人群血清鈣的影響因素(β=0.139,P=0.003)，尿氟與ERα PvuⅡ PP基因型對(duì)血清鎂含量的影響存在交互作用(β=-0.046,P=0.042)。結(jié)論：長(zhǎng)期氟暴露可影響人群血清鈣、鎂含量；ERα基因PvuⅡ多態(tài)性可能影響氟暴露地區(qū)人群血清鎂含量。

近年來(lái)對(duì)氟中毒機(jī)制的研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，氟暴露個(gè)體患病與否及患病程度存在差異，提示氟致機(jī)體損傷中遺傳因素可能起一定作用。已有研究[3-4]提示雌激素受體(estrogen receptor，ER)基因多態(tài)性與骨代謝相關(guān)疾病有關(guān)。氟暴露可影響病區(qū)人群血清鈣、鎂含量[5-6]。目前，有關(guān)人群ERα基因多態(tài)性與血清鈣、鎂含量的關(guān)系，以及不同氟暴露條件下ERα PvuⅡ基因型與成人血清鈣、鎂含量關(guān)系的相關(guān)報(bào)道還較少。作者擬通過(guò)橫斷面研究，分析不同氟暴露水平地區(qū)ERα PvuⅡ多態(tài)性與成人血清鈣、鎂含量的關(guān)系，為今后深入研究氟暴露及ERα基因與骨代謝的關(guān)系提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)和調(diào)查對(duì)象的選擇

1.1.1 調(diào)查點(diǎn)的選擇 2011至2012年，以河南省開(kāi)封市某縣7個(gè)村莊為調(diào)查現(xiàn)場(chǎng)。根據(jù)飲水氟離子濃度，整群抽取高氟村2個(gè)，平均水氟濃度為2.44 mg/L；2008年底實(shí)施了降氟改水工程村2個(gè)，平均水氟濃度為0.36 mg/L；對(duì)照村3個(gè)，平均水氟濃度為0.37 mg/L。除水氟濃度外，7個(gè)村莊的自然條件、人口構(gòu)成、經(jīng)濟(jì)狀況、農(nóng)作物種類、生活習(xí)慣、膳食結(jié)構(gòu)等條件均一致，不存在工業(yè)氟污染源，且其余環(huán)境介質(zhì)氟含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

1.1.2 調(diào)查對(duì)象的選擇 整群抽取所選調(diào)查點(diǎn)18～55歲當(dāng)?shù)爻錾蚓幼? a以上的人群作為調(diào)查對(duì)象，排除患有骨代謝疾病、影響鈣磷代謝疾病和近期接受鈣劑、氟化物、激素治療等人群，共1 032人滿足上述條件，其中高氟組298人(男82人、女216人)，改水組257人(男76人、女181人)，對(duì)照組477人(男174人、女303人)。

1.2 生物樣品的采集 研究對(duì)象于調(diào)查前一日22:00始禁食，次日晨起抽取空腹外周靜脈血10 mL (抗凝和非抗凝各5 mL)于-80 ℃低溫保存,采集晨尿(≥50 mL)于-20 ℃保存。

1.3 生物樣品檢測(cè)分析

1.3.1 尿氟測(cè)定 采用氟離子選擇電極法(儀器購(gòu)自上海水儀科技有限公司)測(cè)定尿氟含量。

1.3.3 ERα PvuⅡ多態(tài)性檢測(cè) 采用全血基因組DNA抽提試劑盒(美國(guó)Axygen Biosciences)提取基因組DNA。參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，由上海博尚生物公司合成；上游引物序列為5’-CTGC CACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’，下游引物序列為5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGAT TATCTGA-3’。采用PCR-RFLP法檢測(cè)ERα PvuⅡ多態(tài)性。PCR體系25 μL，其中基因組DNA 100 ng,2×Taq MasterMix 12.5 μL(北京康為世紀(jì)公司)，ddH2O 6.5 μL，上下游引物濃度均為250 nmol/L。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 20 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，共 35個(gè)循環(huán)；末端延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系30 μL，其中PCR產(chǎn)物10.0 μL、PvuⅡ內(nèi)切酶1.0 μL(立陶宛MBI Fermentas公司)、10×Buffer Tango 2 μL、ddH2O 17 μL，于37 ℃水浴孵育4 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下以酶切條帶確定基因型：存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)的純合子(pp)顯示800和500 bp兩條帶，缺乏PvuⅡ酶切位點(diǎn)的純合子(PP)顯示1 300 bp一條帶，雜合子(Pp)顯示上述3條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用EpiData 2.0，以雙人雙機(jī)獨(dú)立錄入數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0。對(duì)對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)。3組性別構(gòu)成的比較、ERα PvuⅡ基因型分布的比較采用χ2檢驗(yàn)；3組年齡、尿氟及血清鈣、鎂含量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用多重線性回歸模型，分析氟暴露與ERα PvuⅡ多態(tài)性對(duì)人群血清鈣、鎂含量的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)查對(duì)象的基本情況 見(jiàn)表1。由表1可知，3組人群性別分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；改水組和高氟組尿氟水平高于對(duì)照組(P<0.05)，改水組尿氟水平低于高氟組(P<0.05)。

表1 不同組別人群基本變量比較

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與改水組比較，P<0.05。

2.2 3組血清鈣、鎂含量的比較 見(jiàn)表2。由表2可知，改水組男性血清鈣、鎂含量和女性血清鎂含量均低于高氟組和對(duì)照組；高氟組女性血清鈣含量高于對(duì)照組和改水組。

表2 3組血清鈣、鎂含量的比較 mmol/L

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與高氟組比較，P<0.05。

2.3 3組ERα PvuⅡ基因型分布 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)，對(duì)照組ERα PvuⅡ基因型分布符合遺傳平衡(χ2=1.409,P=0.235)。3組ERα PvuⅡ基因型分布結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，無(wú)論男女，3組ERα PvuⅡ基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 3組ERα PvuⅡ基因型分布的比較 人(%)

*：χ2=1.869，P=0.760；#：χ2=2.593，P=0.628。

2.4 ERα PvuⅡ不同基因型攜帶者血清鈣、鎂含量的比較 見(jiàn)表4。由表4可知，攜帶ERα PvuⅡ不同基因型人群間血清鈣、鎂含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 氟暴露與ERα PvuⅡ多態(tài)性對(duì)人群血清鈣、鎂含量的影響 以年齡和性別為調(diào)整因素，以調(diào)查對(duì)象吸煙(“否”=0、“是”=1)、飲酒(同吸煙)狀況，尿氟水平，ERα PvuⅡ基因型(啞變量化，以pp為參照)，尿氟水平與ERα PvuⅡ基因型交互項(xiàng)為自變量，以血清鈣、鎂含量為因變量，建立多重線性回歸模型。經(jīng)分析，血清鈣和血清鎂模型經(jīng)方差檢驗(yàn)均有意義(F=2.538和3.558,P均<0.01)。多重線性回歸結(jié)果(表5)顯示, 尿氟是人群血清鈣含量的影響因素(P<0.05)。尿氟與ERα PvuⅡPP基因型對(duì)人群血清鎂含量的影響存在交互作用。

表4 ERα PvuⅡ不同 基因型攜帶者血清鈣、鎂含量的比較 mmol/L

表5 氟暴露與ERα基因PvuⅡ 多態(tài)性對(duì)人群血清鈣、鎂含量的影響

年齡和性別為調(diào)整因素。

3 討論

3.1 氟暴露對(duì)人群血清鈣、鎂含量的影響 血清鈣、鎂與骨密度關(guān)系密切，且血清鈣、鎂含量是反映骨代謝最常用的指標(biāo)。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期氟暴露可影響機(jī)體血清鈣、鎂含量。該研究結(jié)果顯示，不同氟暴露水平人群血清鈣、鎂含量不同，男性改水組血清鈣含量低于高氟組和對(duì)照組，與閆菊等[11]的研究結(jié)果一致；女性血清鈣含量高氟組高于改水組和對(duì)照組。有研究[12]認(rèn)為，血清鈣調(diào)節(jié)激素在高氟暴露條件下可代償性增高，從而使血鈣維持在正常水平以保證機(jī)體的正常生理功能，而女性體內(nèi)血鈣調(diào)節(jié)途徑更為復(fù)雜，所以男、女之間血清鈣含量的變化特點(diǎn)不一致。該研究結(jié)果顯示，血清鎂含量男、女均表現(xiàn)為改水組低于高氟組和對(duì)照組。白云等[13]研究表明，鎂是三羧酸循環(huán)中某些酶的激活劑，可拮抗氟化物的毒性作用。高氟暴露條件下，機(jī)體血清鎂含量保持正常水平，減弱了體內(nèi)氟化物造成的損害，可部分解釋高氟組與對(duì)照組血清鎂含量無(wú)差異的現(xiàn)象。機(jī)體甲狀旁腺激素(PTH)、降鈣素等激素可通過(guò)多種途徑發(fā)揮其骨代謝調(diào)節(jié)作用。Khandare等[14]研究發(fā)現(xiàn)，慢性氟中毒時(shí)PTH分泌增多。該研究中改水組血清鈣、鎂含量降低，是否與降氟改水后機(jī)體氟攝入量相對(duì)減少，而機(jī)體PTH等激素短時(shí)間不能及時(shí)做出恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)有關(guān)，尚需進(jìn)一步探討。

3.2 氟暴露及ERα PvuⅡ多態(tài)性與人群血清鈣、鎂含量的關(guān)系 目前氟暴露及ERα PvuⅡ多態(tài)性與人群血清鈣、鎂含量關(guān)系的研究較少，但有研究[15]表明雌激素可以刺激成骨細(xì)胞的活動(dòng)，改善骨骼中鈣磷的活動(dòng)狀態(tài)，對(duì)骨細(xì)胞發(fā)育和骨形態(tài)的維持起重要作用。以往有關(guān)ERα PvuⅡ多態(tài)性對(duì)人群骨代謝影響的研究結(jié)果不盡一致。已有研究[16]發(fā)現(xiàn)，ERα PvuⅡ基因多態(tài)性可影響維族婦女腰椎峰值骨量和維持狀態(tài)，攜帶Pp/pp 基因型的維族婦女腰椎BMD值明顯低于PP基因型攜帶者，但在漢族人群中未發(fā)現(xiàn)此種關(guān)聯(lián)，提示ERα PvuⅡ基因型分布以及骨代謝等存在種族差異。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)婦女的研究[17]顯示，ERα PvuⅡ多態(tài)性與絕經(jīng)后婦女骨密度無(wú)關(guān)；而Jeedigunta等[18]研究發(fā)現(xiàn)， 在南印度人群中PP基因型攜帶者骨密度和雌二醇水平較PP基因型攜帶者高。該研究選擇漢族人群為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，ERα PvuⅡ的3種基因型在調(diào)查地區(qū)人群中分布一致。尿氟不僅能反映環(huán)境氟暴露水平，也能反映機(jī)體氟負(fù)荷狀況。以往研究[19]認(rèn)為，尿氟水平與氟攝入量存在正相關(guān)。因此，該研究選擇尿氟為反映氟暴露水平的自變量。該研究多重線性回歸綜合分析結(jié)果顯示，調(diào)整年齡、性別后，人群血清鈣含量與尿氟相關(guān)，提示尿氟可能是影響血清鈣含量的重要因素，與金美玉等[20]報(bào)道的高氟環(huán)境會(huì)影響機(jī)體鈣水平結(jié)果一致。同時(shí)，該研究就尿氟與ERα PvuⅡ多態(tài)性交互作用對(duì)人群血清鈣、鎂含量的影響也進(jìn)行了分析，結(jié)果觀察到二者交互作用影響人群血清鎂含量。血清鈣、鎂含量是反映骨代謝水平的間接指標(biāo)，而機(jī)體骨代謝受多種因素影響，因此要探討氟暴露和ERα PvuⅡ基因多態(tài)性對(duì)骨代謝的影響，尚需進(jìn)一步深入研究。

致謝：感謝參與課題現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查工作的鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、開(kāi)封市疾病預(yù)防控制中心及通許縣疾病預(yù)防控制中心地方病科的工作人員；感謝所有參與此項(xiàng)研究的調(diào)查對(duì)象。

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(2016-01-12收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of fluoride exposure and estrogen receptor α gene PvuⅡ polymorphism on serum calcium and magnesium levels in adults

ZHANGYanli,ZHUJingyuan,CUILiuxin,HOUJiaxiang,ZHOUGuoyu,CHENGXuemin,BAYue

DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

fluoride;estrogen receptor;gene polymorphism;calcium;magnesium

Aim: To study the relationship between estrogen receptor α(ERα) gene PvuⅡ polymorphism and serum calcium and magnesium levels in adults with different fluoride exposure in drinking water.Methods: Local adults who were born there or lived for at least 5 years and aged 18-55 years were recruited as the subjects by cluster sampling in the high fluoride villages, the defluoridation project villages and the control villages. PCR-RFLP was used to determine ERα PvuⅡ genotypes. Serum calcium and magnesium levels were determined by atomic absorption spectrometry method. The fluoride concentration in urine was determined by fluoride ion selective electrode method.Results: Serum calcium and magnesium levels in males and serum magnesium level in females from the defluoridation project group were lower than those from the high fluoride group and the control group, respectively(P<0.05). Serum calcium level in females from the high fluoride group was higher than those from the defluoridation project group and the control group(P<0.05). Multiple linear regression analysis showed that urine fluoride was the major factor affecting serum calcium level(β=0.139,P=0.003), and the interaction between urine fluoride and ERα PvuⅡ PP genotype on serum magnesium level was significant(β=-0.046,P=0.042). Conclusion: Serum calcium and magnesium levels would be affected by long-term fluoride exposure. There was an association between ERα PvuⅡ polymorphism and serum magnesium level in adults exposed to fluoride in drinking water.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.006

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 81072247；河南省教育廳技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 13A330653

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