HBx基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對SUDHL-4細(xì)胞增殖的影響*

張 艷，彭邦安，程旭芳，柏祥芳，牛 帥，王 寧，馬 方，王慶端

1)河南省(鄭州大學(xué))醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州市中心醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450007

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HBx基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對SUDHL-4細(xì)胞增殖的影響*

張 艷1)△，彭邦安2)，程旭芳3)，柏祥芳2)，牛 帥2)，王 寧1)，馬 方1)，王慶端1)

1)河南省(鄭州大學(xué))醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 3)鄭州市中心醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450007

△女，1967年12月生，碩士，副研究員，研究方向：腫瘤藥理，E-mail:zhangyan2008@zzu.edu.cn

HBx基因；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；SUDHL-4細(xì)胞；增殖

目的：研究HBx基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。方法：用分子克隆方法構(gòu)建HBx基因的真核載體pcDNA3.1-X，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-X轉(zhuǎn)入淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4 中，構(gòu)建整合有 HBx基因的淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞SUDHL-4-con作為對照，利用CCK8法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后的增殖活性，繪制生長曲線；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡情況。結(jié)果：重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建pcDNA3.1-X，轉(zhuǎn)染后SUDHL-4細(xì)胞有HBx mRNA及蛋白的表達(dá)。與SUDHL-4組及SUDHL-4-con組相比，SUDHL-4-HBx組細(xì)胞的增殖能力下降，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)論：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因后，SUDHL-4細(xì)胞增殖減緩，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，凋亡率增加。

惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是淋巴結(jié)和(或)結(jié)外部位淋巴組織的免疫細(xì)胞腫瘤，按病理類型分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)。在中國，每年新發(fā)惡性腫瘤中淋巴瘤約占4%，是第九大常見腫瘤，其在腫瘤導(dǎo)致的死亡排名中居第10位，其中以NHL為主，占ML的85%～90%。在每年新診斷的血液系統(tǒng)腫瘤中，淋巴瘤約占一半[1]。在淋巴瘤患者的治療中，常常發(fā)現(xiàn)較多的肝炎病毒陽性患者，兩者的關(guān)系日益受到關(guān)注。國內(nèi)外臨床觀察及研究[2-5]提示HBV感染與B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)有關(guān)，ML的HBV感染率僅次于肝癌。目前HBV感染在NHL發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚不清楚。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(SUDHL-4)是最常見的一種B-NHL，作者采用基因轉(zhuǎn)染的方法將HBx基因轉(zhuǎn)入SUDHL-4細(xì)胞中，觀察HBV對B-NHL細(xì)胞增殖的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為B-NHL的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：SUDHL-4細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。試劑：血液基因組柱式提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司；膠回收試劑盒購自Qiagen公司；載體克隆試劑盒及DH10B感受態(tài)細(xì)胞購自中美泰和生物技術(shù)公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自康為世紀(jì)公司；pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒購自北京天恩澤基因科技有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ及T4連接酶購自NEB公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；Trizol總RNA提取試劑購自康為世紀(jì)公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及細(xì)胞周期檢測試劑盒購自凱基生物有限公司。

1.2 HBx基因的提取、制備 利用血液基因組柱式提取試劑盒提取HBV感染者血清的基因組DNA，根據(jù)GenBank中HBx基因全序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游5’-ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTG TACTG-3’，下游5’-TGCGAATTCTTAGGCAGAGGT GAAAAAGTTG-3’。以上述HBV基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增目的基因，產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳結(jié)果。

1.3 HBx基因測序載體構(gòu)建 利用膠回收試劑盒膠回收目的片段，并用紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度及純度。利用載體克隆試劑盒將目的基因連接在pCloneEZ-TA-Amp/HC載體上后轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選出陽性菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，并取陽性菌落測序鑒定。

1.4 HBx基因真核載體構(gòu)建 根據(jù)pCloneEZ-TA-Amp/HC載體及pcDNA3.1-EGFP載體的酶切位點(diǎn)，選用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，利用 T4連接酶將兩目的片段連接成重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素篩選出陽性單菌落，挑選克隆后提取質(zhì)粒，凝膠電泳及測序鑒定。

1.5 HBx基因轉(zhuǎn)染 將SUDHL-4細(xì)胞接種于含Opti-MEMⅠ無血清培養(yǎng)基的6孔板中，利用Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，命名為SUDHL-4-HBx組，同時(shí)設(shè)空白對照組及轉(zhuǎn)染空載體對照組，分別命名為SUDHL-4組和SUDHL-4-con組，每組3個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞狀態(tài)。

1.6 RT-PCR檢測HBx mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后利用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的純度和濃度，并通過凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性測定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA鏈后通過RT-PCR擴(kuò)增HBx基因，在465 bp處出現(xiàn)條帶則表明HBx基因在SUDHL-4細(xì)胞中成功表達(dá)。

1.7 Western bolt 檢測HBx 蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，利用RIPA Buffer裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，取20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并在恒流200 mA、冰水浴條件下電轉(zhuǎn)60 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L的脫脂奶液封閉液完全封閉1 h，以封閉液按11 000稀釋HBx抗體，將上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后用TBST溶液洗膜，然后與18 000稀釋的二抗孵育1 h后利用ECL試劑發(fā)光顯色，在17 000處出現(xiàn)條帶則表明HBx蛋白在SUDHL-4細(xì)胞中成功表達(dá)。

1.8 CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性 取3組細(xì)胞以1×107L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，4 h后在450 nm波長下檢測各孔OD值，重復(fù)3次取均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定過夜。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用Cell Quest軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞，于染色前用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞并離心，按 AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書操作，于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，用Cell Quest軟件分析細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HBx基因的制備 PCR結(jié)果見圖1。可見464 bp的目的片段，與預(yù)期相符。

1：DNA Marker；2：HBx基因陽性表達(dá)；3：對照。圖1 PCR擴(kuò)增HBx基因結(jié)果

2.2 HBx基因真核載體鑒定 凝膠電泳結(jié)果(圖2)和測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建HBx基因真核載體。紫外分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的濃度為0.145 g/L，其OD260 nm/OD280 nm為1.82，表明重組質(zhì)粒有較高的濃度和純度，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1：DM10000 DNA Marker；2：pcDNA3.1；3：pcDNA3.1-X；4：100 bp DNA Marker。圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞形態(tài)變化 轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察SUDHL-4細(xì)胞的形態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞發(fā)生皺縮，且可以觀察到綠色熒光，見圖3。

A:SUDHL-4組；B:SUDHL-4-con組；C:SUDHL-4-HBx組。圖3 熒光顯微鏡下細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況(×200)

2.4 HBx mRNA的表達(dá) 紫外分光光度計(jì)測得3組細(xì)胞總RNA均有較高的濃度和純度。將各組總RNA進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，其中28S處亮度大約為18S處亮度的2倍，即各組總RNA完整性較好，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，可見SUDHL-4-HBx組有目的片段出現(xiàn)，而其他2組未見mRNA的表達(dá)，見圖4。

1：DNA Marker；2：SUDHL-4-HBx組；3：SUDHL-4組；4：SUDHL-4-con組。圖4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.5 HBx蛋白的表達(dá) Western bolt 結(jié)果顯示SUDHL-4-HBx組在17 000處有蛋白條帶(即HBx蛋白)，而SUDHL-4組和SUDHL-4-con組未見表達(dá)，見圖5。

A:SUDHL-4組；B:SUDHL-4-con組；C:SUDHL-4-HBx組。圖5 3組細(xì)胞中HBx蛋白的表達(dá)

2.6 轉(zhuǎn)染HBx后各組細(xì)胞的生長曲線 與其他2組比較，SUDHL-4-HBx組細(xì)胞增殖減緩，見圖6。

圖6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)UDHL-4細(xì)胞增殖的影響

2.7 轉(zhuǎn)染HBx后各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 SUDHL-4-HBx組與其他2組相比，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率增加，見表1。

表1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx后 各組細(xì)胞周期及凋亡率比較(n=3) %

*：與其他2組相比,P<0.05。

3 討論

淋巴瘤的病因與發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜[6]，其中病毒的慢性感染在淋巴瘤的發(fā)生過程中起重要作用，如EB病毒感染和淋巴瘤的關(guān)系已經(jīng)得到充分證實(shí)。HBV是一種嗜肝細(xì)胞病毒，而且還具有較強(qiáng)的親淋巴細(xì)胞特性，和B細(xì)胞來源的淋巴瘤有關(guān)。大量的臨床研究[2-5]也表明NHL患者HBV感染率明顯高于普通人群及其他實(shí)體腫瘤患者，ML HBV的感染率僅次于肝癌；同時(shí)HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治療中表現(xiàn)突出，這充分表明HBV感染與淋巴瘤的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

HBx蛋白是一種多功能蛋白，對細(xì)胞的凋亡具有雙向調(diào)控作用，可因其細(xì)胞類型、HBV感染階段、細(xì)胞因子及干預(yù)因素等的不同而表現(xiàn)出促進(jìn)或者抑制細(xì)胞凋亡兩種不同的作用。HBx基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能主要通過以下幾種途徑進(jìn)行：上調(diào)c-myc的表達(dá)，使細(xì)胞對TNF-α介導(dǎo)的凋亡信號敏感[7]；拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用；與DDB1競爭性結(jié)合DDB2，以DDB1非依賴形式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；定位線粒體膜，和電壓依賴的離子通道蛋白結(jié)合，使線粒體跨膜電壓下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子的釋放及誘導(dǎo)氧自由基的損傷等[9]。

該實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HBx基因?qū)隨UDHL-4細(xì)胞中，結(jié)果顯示脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后SUDHL-4-HBx組細(xì)胞有HBx mRNA和蛋白的表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBx基因后淋巴瘤細(xì)胞增殖減緩，在G0/G1期發(fā)生細(xì)胞阻滯，細(xì)胞凋亡率顯著增加。

病毒感染宿主細(xì)胞后，病毒蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡是病毒感染過程中的普遍現(xiàn)象[10-11]；HBx基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可促使細(xì)胞免疫逃逸；加強(qiáng)細(xì)胞再生反應(yīng)，促進(jìn)HBV的細(xì)胞感染；還可降低機(jī)體抗炎反應(yīng)，促進(jìn)病毒的擴(kuò)散[12]，這都表明HBx基因誘導(dǎo)凋亡的作用也可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)可揭示HBV感染初期HBx基因?qū)α馨土黾?xì)胞可能的作用機(jī)制，為下一步研究穩(wěn)定表達(dá)HBx基因?qū)UDHL-4細(xì)胞的影響提供參考依據(jù)。

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(2016-07-28收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of HBx gene transient transfection on proliferation of SUDHL-4 cells

ZHANGYan1),PENGBang′an2),CHENGXufang3),BAIXiangfang2),NIUShuai2),WANGNing1),MAFang1),WANGQingduan1)

1)HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)DepartmentofPharmacy,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007

HBx gene;lipofection transfection;SUDHL-4 cell;proliferation

Aim: To investigate the effects of HBx transient transfection on proliferation, cell cycle and apoptosis in lymphoma cell SUDHL-4. Methods: The HBx eukaryon expression vector pcDNA3.1-X was established through recombi nation DNA technique. The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X and empty vector pcDNA3.1 were transfected into SUDHL-4 cells which were named SUDHL-4-HBx and SUDHL-4-con. Untransfected SUDHL-4 and SUDHL-4-con were used as control. The CCK8 experiment was performed to detect the reproductive ability of cells in 24, 48, 72 and 96 h,and growth curves were obtained. Cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results: The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X was identified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing, the expressions of HBx mRNA and protein were confirmed in the SUDHL-4 cells transfected with HBx. Compared with SUDHL-4 group and SUDHL-4-con group, the proliferative capacity of cells in SUDHL-4-HBx group was obviously decreased. Flow cytometry analysis showed that HBx transfection significantly increased G0/G1phase proportion and cell apoptosis rate when comparing with SUDHL-4 and SUDHL-4-con groups(P<0.05). Conclusion: HBx transient transfection could inhibit SUDHL-4 cell proliferation by blocking cell cycle in G0/G1phase and increasing cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.007

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 142102310085

R733.4