siRNA沉默ARK5基因?qū)MMC-7721細胞侵襲及MMP-2蛋白分泌的影響

蔣清虎，馬吉安，譚孝華，吳忠均

1)達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科 達州 635000 2)重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科 重慶 400016

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siRNA沉默ARK5基因?qū)MMC-7721細胞侵襲及MMP-2蛋白分泌的影響

蔣清虎1)△，馬吉安1)，譚孝華1)，吳忠均2)

1)達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科 達州 635000 2)重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科 重慶 400016

△男,1987年8月生,碩士，醫(yī)師，研究方向：肝癌及其機制，E-mail:qinghucqmu@163.com

肝癌；侵襲；ARK5基因；RNA干擾；SMMC-7721細胞

目的：觀察siRNA沉默ARK5基因的表達對肝癌SMMC-7721細胞侵襲及MMP-2蛋白分泌的影響。方法：采用qRT-PCR和Western blot法檢測SMMC-7721細胞和正常肝細胞LO2中ARK5的表達。體外合成靶向ARK5基因的siRNA，轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細胞，并設(shè)陰性對照和空白對照，采用Western blot方法檢測3組細胞中ARK5蛋白的表達，通過Transwell 小室模型檢測細胞的體外侵襲能力，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中MMP-2蛋白的含量。結(jié)果：SMMC-7721細胞中ARK5 mRNA和蛋白的表達水平高于LO2細胞(P<0.05)；沉默ARK5基因后，SMMC-7721細胞的侵襲受到抑制，且MMP-2蛋白的分泌水平低于陰性對照和空白對照(P<0.05)。結(jié)論：沉默ARK5基因可能通過MMP-2途徑抑制SMMC-7721細胞的侵襲。

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，全球每年約60萬人死于肝癌[1]，其發(fā)病率和死亡率分別占所有腫瘤的第6位和第3位[2-3]。HCC確診時常常已是中晚期，大多數(shù)HCC患者已有肝內(nèi)或者肝外轉(zhuǎn)移，腫瘤的轉(zhuǎn)移成為HCC患者死亡的主要原因[4]。因此，尋找HCC轉(zhuǎn)移過程中的重要基因及相互作用蛋白，并以此為靶點開展分子靶向治療有重要意義[5]。ARK5(AMPK-related kinase 5)屬于人腺苷單磷酸激活蛋白激酶家族[6]。已有報道[7-11]表明ARK5在多種腫瘤(胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等)中高表達，并且在體外或體內(nèi)模型中可激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。該研究中，作者首先檢測了肝癌細胞SMMC-7721和人正常肝細胞LO2中ARK5的表達，然后采用ARK5 siRNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，觀察SMMC-7721細胞侵襲能力的變化，探討ARK5在腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料 LO2和SMMC-7721細胞由重慶醫(yī)科大學生命科學院實驗室饋贈；完全培養(yǎng)基及胎牛血清購于Gibco公司；Trizol試劑及PCR引物購于TaKaRa公司；ARK5抗體及GAPDH抗體購于Epitomics公司；ARK5 siRNA(序列為5’-GAAGTTATGCTTTATTCAC-3’)及陰性對照(NC)siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司；Matrigal膠及Transwell小室購于BD公司。RD Diagnostics Quantikine Kit為上海瑞鹿生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 肝癌和正常肝細胞中ARK5 mRNA表達的檢測 采用Trizol試劑分別提取LO2和SMMC-7721細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，用SYBR Premix Ex Taq通過CFX96TM Real-Time System進行mRNA的擴增。引物序列如下：ARK5(221 bp)上游引物5’-GACATGGTTCACAT CAGACGA-3’,下游引物5’-CAATAGTGCACAGCA GAGACG-3’; GAPDH(127 bp)上游引物5’-GGT GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’,下游引物5’-GTT GCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’。PCR反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液 2.4 μL,Taq DNA聚合酶 5.0 μL,上下游引物各0.3 μL,模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)條件：起始94 ℃變性2 min；然后94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。所有qRT-PCR均設(shè)兩個復孔，實驗均重復3次。采用2-ΔΔCt法計算ARK5 mRNA的相對表達量。

1.3 肝癌和正常肝細胞中ARK5蛋白表達的檢測

分別提取LO2和SMMC-7721細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，通過SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，室溫下用50 g/L的脫脂奶粉溶液封閉1 h，加 ARK5抗體 (按1300稀釋)、GAPDH抗體 (按11 000稀釋)，4 ℃過夜，最后加二抗。用ECL發(fā)光試劑盒曝光蛋白條帶，應(yīng)用Scion Image軟件進行條帶灰度值計算。以目的蛋白和GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 SMMC-7721細胞分組和轉(zhuǎn)染 將ARK5 siRNA及NC siRNA轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，分別為siRNA干擾組和陰性對照組，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的空白對照組。轉(zhuǎn)染前細胞通過完全培養(yǎng)基在6孔板中培養(yǎng)24 h，按LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，6 h后換有血清的培養(yǎng)基；48 h后進行后續(xù)實驗。

1.5 3組細胞中ARK5蛋白表達的檢測 取以上3組細胞，同1.3方法檢測ARK5蛋白的表達。

1.6 細胞侵襲實驗 Matrigel在4 ℃隔天融化；用4 ℃預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終質(zhì)量濃度為1 g/L；在Transwell小室的上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel，37 ℃溫育4～5 h使其干成膠狀。將siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組細胞于37 ℃溫育，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌1次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整密度為2×105mL-1。在Transwell小室下室(即24孔板底部)加入800 μL含體積分數(shù)10%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細胞懸液，將無血清培養(yǎng)基平均加到小室。于孵箱中培養(yǎng)48 h，膜上的細胞通過甲醇固定，移到預先加入約800 μL Giemsa染液 的孔中，室溫染色30 min；中性樹膠封片。在白光鏡下選取5個視野(400×)，計數(shù)穿膜細胞。實驗均重復3次。

1.7 MMP-2蛋白分泌水平的檢測 采用ELISA法。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞培養(yǎng)基，按照說明書通過RD Diagnostics Quantikine Kit檢測MMP-2水平。構(gòu)建標準曲線，測得MMP-2蛋白含量的OD值，然后計算蛋白濃度。

1.8 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本的t檢驗比較LO2和SMMC-7721細胞中ARK5蛋白和mRNA表達量的差異，采用單因素方差分析比較siRNA干擾組、陰性對照組和空白對照組的穿膜細胞數(shù)以及MMP-2蛋白的分泌水平，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LO2和SMMC-7721細胞中ARK5 mRNA和蛋白的表達 SMMC-7721細胞中ARK5 mRNA和蛋白的表達水平均高于LO2細胞(圖1、表1)。

2.2 3組細胞中ARK5蛋白的表達、穿膜細胞數(shù)及MMP-2蛋白的分泌水平比較 見圖2、3，表2。

1、2：分別為LO2和SMMC-7721細胞。圖1 LO2和SMMC-7721細胞中ARK5蛋白的表達表1 兩種細胞中ARK5 mRNA和蛋白的表達

細胞系nmRNA蛋白LO231.084±0.3220.384±0.008SMMC-772132.458±0.6440.715±0.013t5.2466.576P<0.001<0.001

A:siRNA干擾組；B:陰性對照組；C:空白對照組。圖2 3組SMMC-7721細胞中ARK5蛋白的表達

A:siRNA干擾組；B:陰性對照組；C:空白對照組。圖3 3組細胞侵襲實驗結(jié)果

表2 3組細胞中ARK5蛋白的表達、 穿膜細胞數(shù)及MMP-2蛋白的分泌水平比較

*：與空白對照組和陰性對照組比較，P<0.05。

3 討論

ARK5屬于人腺苷單磷酸激活蛋白激酶家族成員，在多種腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達并在介導癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7-11]；生存分析[12]顯示ARK5高表達可導致HCC患者極差的預后。作者的前期研究[13]顯示，ARK5在肝癌組織和肝癌細胞SMMC-7721中的表達水平升高，抑制其表達可抑制肝癌細胞生長，促進肝癌細胞凋亡。

該研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞SMMC-7721中ARK5 mRNA及蛋白的表達水平明顯高于正常肝細胞(LO2)。ARK5 siRNA轉(zhuǎn)染可明顯抑制SMMC-7721細胞中ARK5的表達，同時體外侵襲實驗表明抑制ARK5基因后穿膜細胞數(shù)明顯減少，說明抑制ARK5的表達可明顯降低SMMC-7721細胞的侵襲能力，提示ARK5可能是肝癌細胞轉(zhuǎn)移過程中的一個重要因子，可能作為癌基因促進HCC的轉(zhuǎn)移。

有研究[14]報道MMPs是一超過20個成員的鋅-依賴的中性內(nèi)肽酶家族，可促進多種腫瘤細胞外基質(zhì)和基底膜的降解，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，而MMP-2被廣泛認為在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并且也與HCC的遷移及侵襲密切相關(guān)[15-17]。該研究結(jié)果顯示，抑制ARK5的表達后SMMC-7721細胞分泌MMP-2的水平降低。推測抑制ARK5可下調(diào)MMP-2蛋白的分泌，從而抑制SMMC-7721細胞的侵襲力。

總之，ARK5在肝癌細胞SMMC-7721中表達升高，抑制其表達后可抑制肝癌細胞的侵襲，其機制可能與降低MMP-2的表達有關(guān)。ARK5可作為HCC一個新的診斷和治療靶點。

[1]ARAVALLI RN,CRESSMAN EN,STEER CJ.Cellular and molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma: an update[J].Arch Toxicol,2013,87(2):227

[2]FORNER A,LLOVET JM,BRUIX J.Hepatocellular carcinoma[J].Lancet,2012,379(9822):1245

[3]WAGHRAY A,MURALI AR,MENON KN.Hepatocellular carcinoma:from diagnosis to treatment[J].World J Hepatol,2015,7(8):1020

[4]CHEN KW,OU TM,HSU CW,et al.Current systemic treatment of hepatocellular carcinoma:a review of the literature[J].World J Hepatol,2015,7(10):1412

[5]SATO K,MORI M.Evolving molecular mechanism-based strategies for control of hepatocellular carcinoma[J].Curr Med Chem,2011,18(28):4375

[6]SUZUKI A,ESUMI H.AMPK in the cancer research field: tumor progression by ARK5[J].Seikagaku,2006,78(5):392

[7]CHIRUMBOLO S.AMP-activated protein kinase activators, cancer regression, and survival[J].Eur J Cancer Prev,2016,25(3):252

[8]LIU YP,MA YY,WU TF,et al.Mitochondrial respiratory chain complex Ⅰ deficiency due to 10191T>C mutation in ND3 gene[J].Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi,2012,14(8):561

[9]KUSAKAI G,SUZUKI A,OGURA T,et al.ARK5 expression in colorectal cancer and its implications for tumor progression[J].Am J Pathol,2004,164(3):987

[10]LU S,NIU N,GUO H,et al.ARK5 promotes glioma cell invasion, and its elevated expression is correlated with poor clinical outcome[J].Eur J Cancer,2013,49(3):752

[11]CHANG XZ,YU J,LIU HY,et al.ARK5 is associated with the invasive and metastatic potential of human breast cancer cells[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138(2):247

[12]CUI J,YU Y,LU GF,et al.Overexpression of ARK5 is associated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol,2013,34(3):1913

[13]蔣清虎，羅偉，溫路,等.ARK5在肝癌組織中的表達及其對肝癌SMMC-7721細胞生長的影響[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)，2014,40(4)：743

[14]SHUMAN MOSS LA,JENSEN-TAUBMAN S,STETLER-STEVENSON WG.Matrix metalloproteinases:changing roles in tumor progression and metastasis[J].Am J Pathol,2012,181(6):1895

[15]WANG B,DING YM,FAN P,et al.Expression and significance of MMP2 and HIF-1α in hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett,2014,8(2):539

[16]張志超，孫亞欣，賈明庫.基質(zhì)金屬蛋白酶含量及表達與肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)，2006,32(1):116

[17]張博，李曉兵，張鳳霞.多效生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶2與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系研究[J].解放軍醫(yī)學雜志，2012,37(8):805

(2015-12-14收稿 責任編輯徐春燕)

Effect of siRNA silencing ARK5 gene on invasion and secretion of MMP-2 of SMMC-7721 cells

JIANGQinghu1),MAJi'an1),TANXiaohua1),WUZhongjun2)

1)DepartmentofHepatobiliarySurgery，DazhouChineseIntegrativeMedicineHospital，Dazhou635000 2)DepartmentofHepatobiliarySurgery，theFirstAffiliatedHospital，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016

hepatocellular carcinoma;invasion;ARK5;RNA interference；SMMC-7721 cell

Aim: To study the effect of ARK5 gene silencing on the invasion of SMMC-7721 cells. Methods: The expression of ARK5 was determined by qRT-PCR and Western blot in SMMC-7721 and LO2 cells,respectively. ARK5 siRNA was constructed and transfected into SMMC-7721 cells, and negative group and blank group were set up;the expression of ARK5 protein was determined by Western blot,and the invasion of cells in 3 groups were examined by Transwell assay. MMP-2 protein in culture medium was determined by ELISA.Results: The mRNA and protein expression levels of ARK5 in SMMC-7721 cells were significantly higher than those in LO2 cells(P<0.05). After ARK5 siRNA transfection, the invasion of SMMC-7721 cells was significantly inhibited,and MMP-2 protein secreted by the cells was significantly lower than those in negative group and blank group(P<0.05). Conclusion: ARK5 silencing could effectively inhibit invasion of SMMC-7721 cells via MMP-2 pathway.

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