microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌損傷中的作用*

崔瑞新，呂風華，岳 瑩，劉亞坤，高建芝

新鄉醫學院第一附屬醫院心內一科 新鄉 453100

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microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌損傷中的作用*

崔瑞新，呂風華#，岳 瑩，劉亞坤，高建芝

新鄉醫學院第一附屬醫院心內一科 新鄉 453100

#通信作者，女，1970年10月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：冠心病的基礎與臨床研究， E-mail:doctorlvfh@163.com

心肌；缺血-再灌注損傷；microRNA-499；PI3K；Akt；大鼠

目的：探討microRNA-499在大鼠心肌缺血-再灌注損傷(MIRI)中的作用及其與PI3K/Akt通路的關系。方法：將30只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和干預組，每組10只。假手術組僅在冠狀動脈的左前降支下穿線但并不結扎，模型組結扎冠狀動脈左前降支以建立大鼠MIRI模型(缺血30 min,再灌注120 min)，干預組于建立MIRI模型前48 h注射microRNA-499激動劑。采用熒光定量RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中miRNA-499及PI3K mRNA表達量，Western blot法檢測Akt磷酸化活性，采用TTC染色法檢測心肌梗死面積。結果：與假手術組相比，模型組miRNA-499及PI3K mRNA表達量減少，Akt磷酸化活性明顯降低，心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，干預組miRNA-499及PI3K mRNA表達量、Akt磷酸化活性明顯升高，心肌梗死面積明顯減少(P<0.05)。心肌組織中PI3K mRNA與microRNA-499的表達量呈正相關(P<0.05)。結論：microRNA-499可能通過激活PI3K/Akt信號通路，減輕大鼠MIRI。

急性心肌梗死越來越嚴重地影響人類生命健康[1]，在急性心肌梗死發生后及時采用有效手段再通血管、恢復心肌血流是搶救生命的關鍵[2]，但是心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)卻成為挽救缺血心肌的障礙，因此，減輕MIRI成為急性心肌梗死治療成功的重要因素。藥物治療在防治MIRI方面的作用有限。目前發現了多種與MIRI有關的microRNA(miRNA)，使得基因治療或將成為MIRI防治的新手段[3]。MiRNA-499是一種有心肌保護作用的微小RNA[4]，但其保護機制尚不明確。PI3K/Akt信號通路是一種在急性心肌缺血后能夠起到心臟保護作用的信號通道[5]，并且已發現[6-7]有其他miRNA通過激活PI3K/Akt通路而發揮心臟保護作用。該研究旨在揭示miRNA-499的心臟保護作用與PI3K/Akt通路的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 清潔級SD大鼠30只，體重220～280 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司)；miRNA-499激動劑(百奧邁科生物技術有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)；miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒均購于北京天根生化科技有限公司；山羊抗兔IgG(H+L)、山羊抗小鼠IgG(H+L)購于北京天德悅生物科技有限責任公司；GAPDH鼠單抗(美國Immunoway公司)。

1.2 實驗分組及方法 30只大鼠隨機分為3組，每組10只。假手術組：大鼠開胸后僅在冠狀動脈左前降支下穿線但不結扎。模型組：對心臟冠狀動脈左前降支實施缺血30 min、再灌注120 min[8]。干預組：大鼠按10 mg/kg尾靜脈注射miRNA-499激動劑，48 h后行MIRI手術。每組取5只大鼠于再灌注結束時迅速摘取心臟組織并用預冷的無菌生理鹽水充分沖洗心臟內外的血液，剪去多余部分,只保留左心室區域，迅速放置于無菌無熱源凍存管內，液氮罐中速凍，隨后置于-80 ℃冰箱中保存，備檢PI3K mRNA、miRNA-499及Akt蛋白磷酸化活性。每組余5只大鼠于再灌注末摘取整個心臟后用生理鹽水沖洗，隨后用濾紙吸干其表面的水分，將整個心臟快速放入-20 ℃冰箱，備檢心肌梗死面積(IS)。

1.3 心肌組織中PI3K mRNA、miRNA-499的檢測

采用熒光定量RT-PCR法檢測。PI3K上游引物:5’-CAAGGAAAAATGCCCTATTGAAGAA-3’，下游引物：5’-TGTGCCTGTCACCTATCCCAAGA-3’；內參GAPDH上游引物:5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。miRNA-499上游引物：5’-TTAAGACTTGCAGTGAT GTTT-3’；內參U6上游引物：5’-CTGCGCAAGGAT GACACGCAAATT-3’。 引物均由Invitrogen公司合成。采用Trizol提取心肌細胞RNA，經Poly(A)加尾，按照試劑盒說明書逆轉錄得cDNA，再行PCR，PCR反應條件如下。PI3K：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃5 s變性；60 ℃40 s(采集SYBR熒光信號)，45個循環。miRNA-499：94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 20 s變性；60 ℃34 s(采集SYBR熒光信號)，45個循環。通過2-ΔΔCt法計算miRNA-499和PI3K mRNA表達量。

1.4 心肌組織中Akt蛋白磷酸化活性的檢測 大鼠心肌組織研磨后加入0 ℃RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑(檢測磷酸化蛋白即P-Akt時需同時加入磷酸酶抑制劑)提取蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度。以RIPA調整蛋白濃度，配制120 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠進行電泳，以孔徑為0.45 μm NC膜進行轉膜，BSA-TBST封閉30 min，一抗分別為P-Akt兔單抗(12 000)、Akt兔多抗(15 000)、GAPDH鼠單抗(120 000)，孵育10 min，4 ℃過夜，二抗分別為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(H+L)(110 000)或山羊抗小鼠IgG(H+L)(110 000),室溫孵育40 min。ECL化學發光法使條帶顯影，用成像軟件掃描膠片并保存圖片，用Image J圖像分析軟件測定條帶的灰度值。Akt蛋白磷酸化活性以P-Akt與Akt條帶灰度值的比值來表示。

1.5 心肌IS的測定 將整個心臟標本速凍20 min后取出，由心尖至心基底部切取4～5片，片厚2 mm，置入用PBS配制的10 g/L TTC溶液中，37 ℃水浴溫孵25 min左右，再放入甲醛溶液中固定10 min，然后于解剖顯微鏡下觀察并分離缺血危險區和心肌梗死區，缺血危險區呈紅色，心肌梗死區呈白色。待干燥后，將分離好的心肌組織分別稱重。IS=梗死區心肌質量/缺血區心肌質量×100%[9]。

1.6 統計學處理 應用SPSS 19.0處理數據， 3組miRNA-499、PI3K mRNA表達量及Akt蛋白磷酸化活性、IS的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，對PI3K mRNA的表達與miRNA-499的表達進行Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組心肌組織中PI3K mRNA和miRNA-499表達量的比較 見表1。與假手術組相比，模型組miRNA-499、PI3K mRNA表達量降低，干預組較模型組升高(P<0.05)，其中miRNA-499表達量高于假手術組(P<0.05)。

2.2 3組心肌組織中Akt磷酸化活性的比較 見圖1、表1。與假手術組相比，模型組Akt磷酸化活性降低,干預組較模型組和假手術組升高(P<0.05)。

表1 3組大鼠心肌各指標的比較

*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

1：假手術組；2：模型組；3：干預組。圖1 3組Akt磷酸化活性測定

2.3 3組IS的比較 見圖2、表1。與假手術組相比，模型組IS增加;干預組較模型組明顯減小(P<0.05)，但仍大于假手術組(P<0.05)。

左：干預組；中：模型組；右：假手術組。圖2 各組IS檢測

2.4 心肌組織中PI3K mRNA與miRNA-499表達的相關性 Pearson相關分析顯示，假手術組、模型組和干預組中PI3K mRNA與miRNA-499的表達量均呈正相關(r=0.774、0.548和0.633，P均<0.05)。

3 討論

MiRNA是一類大小約22個核苷酸的非編碼RNA分子，可通過與靶基因mRNA的特定位點結合,抑制蛋白的合成或誘導該mRNA的降解，從而參與基因的表達調控。miRNA調控著許多細胞進程，包括細胞增殖、分化、凋亡和細胞吞噬[10]。多種與冠心病相關的miRNA例如miRNA-133、miRNA-126、miRNA-21、miRNA-499已經被發現。

MiRNA-499在骨骼肌和心肌組織中表達豐富。Wang等[11]的研究表明miRNA-499在生理狀態的心肌中表達量非常高，在MIRI的心肌中表達降低；通過調控miRNA-499的表達可以改善由缺血-再灌注引起的心肌細胞凋亡和心功能的改變。有研究[12-13]表明miRNA-499具有急性心肌梗死早期血漿生物標記物的作用，且循環血中miRNA-499可作為心臟外科手術圍手術期心肌梗死的早期診斷指標。該研究中，作者建立了MIRI模型，并用miRNA-499激動劑對模型大鼠進行預處理。結果顯示，模型組大鼠心肌組織中miRNA-499的表達量較假手術組明顯減少，心肌發生大面積的梗死；而干預組雖也建立了MIRI模型，但因用miRNA-499激動劑預處理，其miRNA-499的表達水平明顯高于模型組，甚至高于假手術組，同時干預組大鼠IS較模型組明顯降低，與Wang等[11]的研究結果一致，進一步證實了miRNA-499的心臟保護功能。

MIRI時機體會激活多種保護性通道以減輕心臟損傷[14]，PI3K/Akt信號通路便是其中一種，Akt是PI3K的主要下游效應分子[15]。部分miRNA可通過下調PI3K/Akt信號通路中的PETN活性激活Akt磷酸化,從而起到心肌保護作用[16]。該研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中PI3K mRNA表達水平和Akt磷酸化活性較假手術組顯著降低，而干預組心肌組織中二者均較模型組顯著升高，并且Akt磷酸化活性與miRNA-499的表達量呈正相關。這有可能證明miRNA-499通過激活PI3K/Akt信號通路而發揮心臟保護作用。

總之，隨著分子和細胞機制的研究越來越豐富和深入，臨床基因治療MIRI的可能性也越來越大[17]，miRNA-499或可成為急性心肌梗死的早期診斷標志和治療靶點。

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(2016-03-16收稿 責任編輯王 曼)

Effect of microRNA-499 targeted at PI3K/Akt signaling pathway on myocardial ischemia-reperfusion in rats

CUIRuixin,LYUFenghua,YUEYing,LIUYakun,GAOJianzhi

FirstDepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstClinicalCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453100

myocardium;ischemia-reperfusion injury;microRNA-499;PI3K;Akt;rat

Aim: To investigate the effect of miRNA-499 on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) of rats and its relation with PI3K/Akt signaling pathway. Methods: Thirty SD rats were randomly assigned into sham-operation group, model group, and precondition group with 10 rats in each group. In the sham-operation group, the thread was only threaded under left anterior descending coronary artery(LAD) but not ligated; in model group, MIRI models were built by ligating LAD with 30 min ischemia and 120 min reperfusion; in the precondition group, rats were injected miRNA-499 agomir 48 h before MIRI operation. Real Time RT-PCR was adopted to detect the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, Western blot was adopted to detect Akt phosphorylation level, and the myocardial infarction size were measured using TTC staining. Results: Compared with sham-operation group, the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, and the Akt phosphorylation level in model group were significantly lower,and the infarction size were larger(P<0.05). Compared with those in MIRI group, the expressions of miRNA-499 and PI3K mRNA, and the Akt phosphorylation level in precondition group were obviously higher,while the infarction size was smaller(P<0.05). The expression of microRNA-499 was positively related to that of PI3K mRNA(P<0.05)。Conclusion: microRNA-499 could reduce MIRI via activating the PI3K/Akt signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.013

R542.2

*河南省高等學校青年骨干教師資助計劃 2009GGJS-085