甘草次酸對哮喘大鼠的抗氧化應激作用及NF-κB信號通路的調控*

陳 偉，馬 磊，楊立山

寧夏醫科大學總醫院急診科 銀川 750004

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甘草次酸對哮喘大鼠的抗氧化應激作用及NF-κB信號通路的調控*

陳 偉，馬 磊，楊立山#

寧夏醫科大學總醫院急診科 銀川 750004

#通信作者，男，1965年4月生，碩士，教授,主任醫師，研究方向：臨床藥理學，E-mail：nyfyyls@126.com

甘草次酸；支氣管哮喘；NF-κB；氧化應激；大鼠

目的：探討甘草次酸對哮喘大鼠肺組織NF-κB、IL-6、IL-5蛋白表達及抗氧化應激能力的影響。方法：采用卵清白蛋白致敏法制備大鼠支氣管哮喘模型，并給予甘草次酸高、中、低(200、100、50 mg/kg)劑量進行干預；同時設正常對照和地塞米松對照；每組10只大鼠。干預7 d后處死大鼠，用生化法測大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，用RT-PCR和Western-blot法測大鼠肺組織NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA及蛋白表達水平。結果：與正常對照比較，模型組和GA各劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px及T-AOC水平降低，MDA水平升高，肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較，甘草次酸高、中劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px水平升高， MDA水平降低(P<0.05)，肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)，其中甘草次酸高劑量組變化更顯著。結論：甘草次酸對哮喘大鼠氧化應激有拮抗作用，其機制與調控NF-κB信號通路有關。

支氣管哮喘是由多種炎性細胞、細胞因子及氧化應激參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種重要的轉錄調節因子，具有廣泛的細胞調節功能，參與炎癥和免疫反應的調控，與哮喘的發生發展密切相關[2]。氧化應激(oxidative stress，OS)是指體內氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，介導氣道炎癥發生和高反應性，加重哮喘[3]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)是從豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)根莖中提取的一種重要的有效活性成分，屬五環三萜皂苷類化合物，在結構上與甾體類激素相似，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗心律失常及腎上腺皮質激素樣作用[4]。作者采用卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏法復制支氣管哮喘大鼠模型，觀察GA對模型大鼠肺組織中NF-κB信號通路及氧化應激水平的影響，探討其抗哮喘機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，體重160～200 g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供(合格證：醫動字08-005)，普通飲食水飼養。GA(純度 ≥98%)購自南京景竹生物科技有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液(dexamethasone，DEX)購自天津金耀藥業有限公司，批準文號2020514；OVA(GradeⅡ)為Sigma公司進口分裝產品，批號A-5253；氫氧化鋁為天津市化學試劑三廠產品，批號20101125；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑(BBI，Kitchener, Ont., Canada公司)；RevertAidTMFirst strand cDNA 合成試劑盒(Ferments, GlennBurnie, Md., 美國)；引物由上海生工生物工程有限公司合成；兔抗大鼠NF-κB、IL-6、IL-15及β-actin抗體購自Santa Cruz公司；細胞裂解液、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、蛋白定量試劑盒、PVDF膜等購自武漢博士德生物工程有限公司。YLS-8A多功能誘咳引喘儀(山東省醫學科學院設備站)；752N紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；WH-861旋渦混勻器(太倉市科教器材廠)；TGL-16/TGL16型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；電子天平(BS200s-WEI，德國塞多利斯)檢測范圍1 mg～210 g；HH-W420恒溫水浴箱(常州中捷實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗分組 取大鼠60只，隨機分為6組，分別為正常對照組，哮喘模型組，DEX組和GA低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組，其他5組采用OVA致敏法復制支氣管哮喘大鼠模型[5]：于第1天和第7天腹腔注射新鮮配制的1 mg OVA+200 mg 氫氧化鋁+1 mL 生理鹽水混懸液0.2 mL;第8天將致敏大鼠置于誘咳引喘儀霧化箱中，用含10 g/L OVA的生理鹽水進行霧化激發，每次30 min。正常對照組第1天和第7天腹腔注射生理鹽水0.2 mL，用生理鹽水進行霧化激發。第9日起在每次激發前2 h給藥：正常對照組與模型組給予生理鹽水1 mL/kg灌胃， DEX組腹腔注射DEX 0.5 mg/kg，GA低、中、高劑量組分別按50、100、200 mg/kg灌胃GA，連用7 d。末次激發后24 h，水合氯醛腹腔麻醉大鼠，經腹主動脈取血備查，然后處死大鼠，取肺組織置于液氮中儲存備用。

1.3 血清指標測定 取血后，2 500 r/min離心10 min分離血清，采用生化法測定SOD、MDA、T-AOC及GSH-Px。

1.4 肺組織NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA的檢測 提取大鼠肺組織總RNA，采用RT-PCR法檢測NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA表達水平。NF-κB引物序列上游：5’-GCGCATCCAGACCAACAATAA-3’，下游：5’-GCCGAAGCTGCATGGACACT-3’；IL-6引物序列上游：5’-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3’，下游：5’-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3’；IL-5引物序列上游：5’-ACCTTCCAGGATGAGGACATGA-3’，下游：5’-GATTCTTTCCTTTGAGGCCCA-3’；β-actin引物序列上游：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 35 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環；72 ℃延伸 10 min。取擴增產物8 μL于25 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像，讀取條帶光密度值,以目的條帶與β-actin條帶光密度值的比值表示目的mRNA的表達水平。

1.5 肺組織NF-κB、IL-6及IL-5 蛋白的檢測 取肺組織置于1～2 mL勻漿器中，加400 μL 單去污劑裂解液(含PMSF)進行勻漿，使組織盡量碎裂；充分裂解30 min，提取蛋白并調整蛋白濃度，加入2×SDS Loading buffer，95 ℃水浴煮沸5 min進行蛋白變性。120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳并轉膜，50 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，然后加一抗室溫孵育2 h，加二抗孵育1 h，凝膠成像儀下顯色觀察，記錄條帶光密度值，以目的條帶與β-actin條帶光密度值之比表示目的蛋白的表達水平。

1.6 統計學處理 數據處理使用SPSS 16.0。6組肺組織中各mRNA和蛋白表達水平的比較及血清指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 6組大鼠血清SOD、MDA、T-AOC及GSH-Px的比較 見表1。與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠血清SOD、GSH-Px及T-AOC水平下降，MDA水平升高(P<0.05)。與哮喘模型組比較，GA高劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px水平均升高，MDA水平降低(P<0.05)，GA中、低劑量組變化不顯著。

表1 6組大鼠血清SOD、 MDA、T-AOC及GSH-Px的比較

*：與正常對照組比較，P<0.05；△:與哮喘模型組比較，P<0.05。

2.2 6組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA表達水平的比較 見圖1、表2。與正常對照組比較，哮喘模型組和GA各劑量組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA表達水平增高(P<0.05)。與哮喘模型組比較，GA高、中劑量組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA表達水平降低(P<0.05)，其中高劑量組變化更顯著。

2.3 6組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5蛋白表達的比較 見圖2、表3。與正常對照組比較，哮喘模型組和GA各劑量組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。與哮喘模型組比較，GA高、中劑量組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5蛋白表達水平降低(P<0.05)，其中高劑量組變化更顯著。

1：正常對照組；2：哮喘模型組；3：DEX組；4：GA高劑量組；5：GA中劑量組；6：GA低劑量組。圖1 6組大鼠肺組織中NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA的檢測表2 6組大鼠肺組織中 NF-κB、IL-6及IL-5 mRNA表達水平的比較

組別nNF-κBIL-6IL-5正常對照組100.22±0.040.18±0.020.26±0.04哮喘模型組100.79±0.02*0.82±0.05*0.80±0.01*DEX組100.57±0.06*△0.57±0.03*△0.59±0.03*△GA高劑量組100.48±0.04*△0.51±0.05*△0.40±0.03*△GA中劑量組100.58±0.02*△0.61±0.04*△0.64±0.05*△GA低劑量組100.73±0.03*△0.87±0.05*0.77±0.05*F91.969353.690314.730P<0.001<0.001<0.001

*：與正常對照組比較，P<0.05；△:與哮喘模型組比較，P<0.05。

1：正常對照組；2：哮喘模型組；3：DEX組；4：GA高劑量組；5：GA中劑量組；6：GA低劑量組。圖2 6組大鼠肺組織中 NF-κB、IL-6及IL-5蛋白表達水平的比較表3 6組大鼠肺組織中 NF-κB、IL-6及IL-5蛋白表達水平的比較

組別nNF-κBIL-6IL-5正常對照組100.33±0.100.19±0.040.26±0.08哮喘模型組100.92±0.08*0.93±0.05*0.81±0.04*DEX組100.42±0.02△0.28±0.06*△0.28±0.03△GA高劑量組100.46±0.07*△0.33±0.04*△0.46±0.07*△GA中劑量組100.55±0.08*△0.54±0.09*△0.54±0.06*△GA低劑量組100.88±0.03*0.80±0.06*△0.79±0.09*F127.420256.62040.693P<0.001<0.001<0.001

*：與正常對照組比較，P<0.05；△:與哮喘模型組比較，P<0.05。

3 討論

哮喘是氣道常見的慢性炎癥之一，其發生與細胞因子、炎癥介質、趨化因子及多種酶等的表達異常有關。氧化應激是哮喘的主要表現之一，是機體氧化與抗氧化失衡的結果。哮喘發作時，各種炎癥細胞和免疫細胞被激活并產生大量活性氧(ROS)，ROS可誘發脂質過氧化、DNA損傷和蛋白質變性等，同時還可活化NF-κB等轉錄因子，促進一些炎癥因子的表達，進一步加重哮喘反應[6]。為防止氧化應激對機體的損傷，機體通常會產生抗氧化劑來抵御氧自由基的損害，SOD、GSH-Px是體內重要的自由基清除劑，可抵御機體的過氧化反應。MDA是一種重要的脂質過氧化產物，T-AOC與機體抗氧化能力密切相關。上述指標的血清水平可間接反映機體氧化應激程度和防御氧自由基損害的能力[7-8]。

NF-κB是一種調節基因轉錄的關鍵核蛋白，具有廣泛的生物學活性，可調控炎癥介質及細胞因子的轉錄，在炎癥和免疫反應中至關重要[9]。當細胞受到刺激時，NF-κB的誘導劑通過激活胞漿中的I-κB激酶使I-κB發生磷酸化和泛素化，最后使NF-κB/I-κB二聚體復合物解離，游離的NF-κB迅速通過核膜上的受體被轉運至細胞核內，與DNA分子中的特異性位點結合，從而快速啟動靶基因(IL-6、IL-5等)轉錄，生成相應的mRNA和蛋白質[10]。同時，NF-κB作為上游轉錄調控因子，可誘導IL-6、IL-5等細胞因子過度或持續表達，進而促使大量的炎癥細胞(中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等)浸潤和聚集于損傷部位，誘導生成NO、PG等介質，導致炎癥反應。IL-6、IL-5等細胞因子又是NF-κB的活化劑，可進一步激活NF-κB，引發持續或放大的炎癥反應[11]。研究[12]報道，NF-κB參與了哮喘的發生和發展，哮喘患者氣道黏膜下細胞、痰中細胞、上皮細胞及支氣管活檢標本中NF-κB的活性和表達量較正常人明顯增高。IL-5、IL-6的表達主要受NF-κB調控，當NF-κB被激活，IL-5和IL-6的生成相應增多，致使IgE合成增多，形成嗜酸性粒細胞性炎癥，對氣道產生持續浸潤，加速加重哮喘的發作[13-14]。

該研究結果顯示，200、100 mg/kg的GA可明顯降低哮喘大鼠血清MDA含量，增加大鼠血清SOD、GSH-Px水平，明顯降低哮喘大鼠肺組織NF-κB、IL-5及IL-6 mRNA和蛋白表達水平，提示GA可能通過抑制NF-κB向核內轉移，減少炎癥介質IL-5、IL-6等的轉錄和合成，從而拮抗大鼠哮喘時的氧化應激狀態，對哮喘大鼠有一定的保護作用，其作用機制可能與調控NF-κB信號通路有關。

[1]DUNN RM,WECHSLER ME.Anti-interleukin therapy in asthma[J].Clin Pharmacol Ther,2015,97(1):55

[2]CHEN M,LV Z,ZHANG W,et al.Triptolide suppresses airway goblet cell hyperplasia and Muc5ac expression via NF-κB in a murine model of asthma[J].Mol Immunol,2015,64(1):99

[3]楊明,李國平.氧化應激激活的信號傳導與支氣管哮喘的研究進展[J].重慶醫學,2014,43(7):875

[4]LUO J,LIU M,WU X,et al.DGAEE, a newly synthesized derivative of glycyrrhetinic acid, potently attenuates mouse septic shock via its main metabolite DGA in an IL-10-dependent manner[J].Int Immunopharmacol,2015,29(2):583

[5]杜芳宇,劉劍波.吡格列酮對哮喘小鼠肺組織 GABAARα、MUC5AC表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(1):33

[6]王堯,楊青,郭鋒,等.哮喘氣道重塑與氧化應激的實驗研究[J].華中科技大學學報(醫學版),2011,40(4):457

[7]羅世杰,唐志書,張玲,等.熱喘平口服液對支氣管哮喘豚鼠一氧化氮、腫瘤壞死因子-α、超氧化物歧化酶及丙二醛的影響[J].河北中醫,2011,33(4):589

[8]張鐵栓,張國俊,劉穎.還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞的保護作用[J].鄭州大學學報(醫學版),2013,48(1):70

[9]林益平,李昌崇,胡野,等.哮喘大鼠IKK/NF-κB信號通道與抗氧化性的關系及銀杏葉提取物的調控[J].中國病理生理雜志,2006,22(7):1388

[10]YOUN DH,WANG H,JEONG SJ.Exogenous tumor necrosis factor-alpha rapidly alters synaptic and sensory transmission in the adult rat spinal cord dorsal Horn[J].J Neurosci Res,2008,86(13):2867

[11]LAWRENCE T.The Nuclear Factor NF-kappa B Pathway in Inflammation[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2009,1(6):a001651

[12]馬秀琴,黃茂,卞濤,等.地塞米松對哮喘大鼠肺組織NF-κB和MMP-9及TIMP-1表達的影響[J].南京醫科大學學報(自然科學版),2005,25(4):255

[13]尹靜波.炎性細胞因子在支氣管哮喘發病機制中的作用[J].國際檢驗醫學雜志,2011,32(10):1087

[14]GARCIA G,TAILLé C,LAVENEZIANA P,et al.Anti-interleukin-5 therapy in severe asthma[J].Eur Respir Rev,2013,22(129):251

(2016-03-08收稿 責任編輯王 曼)

Effects of glycyrrhetinic acid on oxidative stress and NF-κB signal pathway in bronchial asthma rats

CHENWei,MALei,YANGLishan

DepartmentofEmergency,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004

glycyrrhetinic acid;bronchial asthma;NF-κB;oxidative stress；rat

Aim: To investigate the effects of glycyrrhetinic acid(GA) on the NF-κB signal pathway and anti-oxidative stress capability in experimental asthma rats. Methods: Ovalbumin allergization was used to establish bronchial asthma rat model, and the model rats were given GA(200, 100, 50 mg/kg) through intragastric administration once a day for 7 days, respectively,blank control, asthma model control and dexamethasone control were employed in the experiment,and 10 rats were in each group. The levels of SOD, MDA, GSH-Px and T-AOC in serum were determined by biochemical methods. The mRNA and protein expressions of NF-κB, IL-6 and IL-5 in lung tissue were determined by RT-PCR and Western blot,respectively. Results: Compared with the blank control group, the activity of SOD, GSH-Px and T-AOC in serum of asthma model control group and 3 GA groups decreased, the serum level of MDA was higher, and the mRNA and protein expressions of NF-κB, IL-6 and IL-5 in lung tissue were higher(P<0.05). Compared with the asthma model control group, the activity of SOD and GSH-Px in serum of 200 and 100 mg/kg GA group were higher, the serum level of MDA was lower, the mRNA and protein expressions of NF-κB, IL-6 and IL-5 in lung tissue were lower(P<0.05),and the changes of 200 mg/kg GA group were more obvious. Conclusion: GA has the capability to against oxidative stress in asthma rats, which may be related to the NF-κ B signal pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.018

*寧夏科技支撐計劃項目(2015)

R285.5