下調(diào)Ets2表達(dá)對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長及mTOR/p70S6K信號通路的影響*

韓 康，馬珊珊，李慶華，王欣欣，朱相展，孟 楠，韓 莉，關(guān)方霞1，#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

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下調(diào)Ets2表達(dá)對裸鼠食管鱗癌移植瘤生長及mTOR/p70S6K信號通路的影響*

韓 康1)，馬珊珊1)，李慶華1)，王欣欣2)，朱相展1)，孟 楠2)，韓 莉2)，關(guān)方霞1，2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

#通信作者，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：生物醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com

Ets2；siRNA；Eca109；裸鼠；凋亡；mTOR/p70S6K信號通路

目的：探討下調(diào)Ets2表達(dá)對裸鼠Eca109移植瘤生長及mTOR/p70S6K信號通路的影響。方法：選擇已篩選出的在體外靶向下調(diào)Ets2基因表達(dá)的siRNA片段，構(gòu)建包含此片段的慢病毒(LV-siEts2)并感染Eca109，15只裸鼠隨機分為空白對照組、陰性對照組和LV-siEts2組，分別背部皮下接種Eca109、LV感染的Eca109和LV-siEts2感染的Eca109，形成移植瘤，之后觀察腫瘤生長情況、繪制腫瘤生長曲線并計算腫瘤抑制率。應(yīng)用qRT-PCR檢測腫瘤組織中Ets2 mRNA的表達(dá)，TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞的凋亡，Western blot法檢測腫瘤組織中Ets2、Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin以及mTOR/p70S6K信號通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果：LV-siEts2組腫瘤生長速度明顯變慢，腫瘤體積和質(zhì)量顯著小于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)；LV-siEts2組腫瘤組織中Ets2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低；LV-siEts2能引起Eca109細(xì)胞的凋亡，且上調(diào)Caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)水平，而下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；LV-siEts2能顯著降低mTOR及p70S6K的蛋白表達(dá)。結(jié)論：LV-siEts2在體內(nèi)通過抑制mTOR/p70S6K信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制裸鼠Eca109移植瘤的生長。

食管癌是常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)癌癥病死患者中居第6位，食管癌有兩種組織學(xué)類型，在中國以食管鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)為主[1]，食管鱗癌細(xì)胞具有高惡性、低分化的特點。Ets2是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，與腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展密切相關(guān)。體內(nèi)外研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，前列腺癌、乳腺癌、食管癌等多種腫瘤中Ets2的表達(dá)存在異常；肺腺癌中Ets2基因的表達(dá)降低；而食管鱗癌組織中Ets2基因表達(dá)增加[4-5]。作者課題組前期體外研究[6]發(fā)現(xiàn)，Eca109中Ets2蛋白的表達(dá)增加，使用siRNA靶向下調(diào)Ets2的表達(dá)能有效抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種在進(jìn)化上高度保守的蛋白激酶，也是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞的生長、增殖、分化和遷移上起著關(guān)鍵調(diào)控作用[7-8]。大量研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤的發(fā)生和mTOR/p70S6K信號通路的異常關(guān)系密切。因此，該實驗通過慢病毒(LV)介導(dǎo)的siRNA，靶向下調(diào)Eca109中Ets2的表達(dá)，研究下調(diào)Est2表達(dá)對裸鼠食管鱗癌移植瘤的生長及mTOR/p70S6K信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和FBS購自Gemini公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司，Caspase-3和Bcl-2抗體購自上海生工生物技術(shù)有限公司，E-cadherin購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，mTOR和p70S6K抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Ets2抗體購自美國Santa Cruz公司，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，LV由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，食管鱗癌細(xì)胞株Ecal09購自中國科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫。

1.2 LV感染Eca109細(xì)胞 實驗室前期已篩選出有效下調(diào)Ets2表達(dá)的siRNA片段(上游5’-GCAGCA ACUUGAAUUUGCUTT-3’,下游5’-AGCAAAUUCA AGUUGCUGCTT-3’)，送交吉凱基因制備慢病毒。按照吉凱基因提供的慢病毒使用操作說明書進(jìn)行LV感染。按照比例擴大原則將Eca109接種于6孔板中，細(xì)胞40%融合狀態(tài)時進(jìn)行LV感染，取6.6 μL LV原液和4 μL LV-siEts2原液分別加到1 mL Enis中混勻，逐滴加到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)基，待融合狀態(tài)達(dá)90%進(jìn)行傳代擴大培養(yǎng)。感染3～4 d后，觀察熒光表達(dá)情況。采用Western blot檢測Eca109細(xì)胞中Ets2蛋白的表達(dá)。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立及實驗分組 雄性5周齡BALB/c裸鼠，體重25～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(京) 2003-0002] ,在鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件達(dá)到SPF級，裸鼠在新環(huán)境下適應(yīng)10 d開始進(jìn)行實驗。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，每只裸鼠接種200 μL(3×107mL-1)細(xì)胞懸液。裸鼠分為3組，每組5只。空白對照組：注射Eca109；陰性對照組：注射LV空載病毒感染的Eca109；LV-siEts2組：注射LV-siEts2病毒感染的Eca109。接種細(xì)胞1周后開始隔天測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，共測量7次，按照公式V=0.5ab2計算腫瘤的體積變化并繪制生長曲線。測量完畢后處死裸鼠，取出腫瘤并稱重，腫瘤抑制率=(對照組瘤重-實驗組瘤重) /對照組瘤重×100%。

1.4 qRT-PCR檢測腫瘤組織中Ets2 mRNA的表達(dá)

根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取腫瘤組織總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用Fast7500 Real Time System進(jìn)行qRT-PCR，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參。Ets2引物序列：上游5-TTTCG GAATCAAGAATATGGACCAG-3’，下游5’-AGGGACCC ATCAAAGGTGTCAA-3’。GAPDH引物序列：上游5’-AACCACTCCTCCACCTTTGA-3’；下游5’-CTGTTGCTG TAGCCAAATTCGT-3’。

1.5 TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞的凋亡 按照TUNEL凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，腫瘤組織石蠟切片經(jīng)過脫蠟、促滲、通透、封閉后滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗片，擦干周圍水分，滴加50 μL Streptavidin-FITC標(biāo)記工作液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS洗片后滴加50 μL Anti-FITC工作液，37 ℃避光反應(yīng)30 min，最后經(jīng)過DAB染色和蘇木素復(fù)染即可在顯微鏡下觀察，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 Western blot法檢測腫瘤組織中Ets2、Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin以及mTOR/p70S6K信號通路蛋白的表達(dá) 每組取40 mg腫瘤組織磨成粉末，加入300 μL蛋白裂解液，過夜裂解，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液并測定蛋白濃度，加入等體積2×loadding buffer煮沸，每組分別取50 μg總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入兔抗人Caspase-3抗體(稀釋500倍使用)、兔抗人E-cadherin抗體(稀釋1 000倍使用)、兔抗人Bcl-2抗體(稀釋500倍使用)、兔抗人mTOR抗體(稀釋1 000倍使用)、兔抗人p70S6K抗體(稀釋1 000倍使用)、兔抗人Ets2抗體(稀釋200倍使用)或兔抗人GAPDH抗體(稀釋2 000倍使用)，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，山羊抗兔HRP抗體(稀釋2 000倍使用)室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法成像，結(jié)果掃描后使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0分析。3組間腫瘤質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞凋亡率的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LV感染Eca109細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察結(jié)果

陰性對照和LV-siEts2組均有綠色熒光表達(dá)，表明LV成功感染Eca109細(xì)胞，見圖1。

A:陰性對照組;B:LV-siEts2組。圖1 LV感染Eca109細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(×200)

2.2 各組Eca109細(xì)胞中Ets2蛋白的表達(dá) 與空白對照組相比，LV-siEts2組細(xì)胞中Ets2蛋白表達(dá)降低(圖2)，LV-siEts2成功下調(diào)Eca109中Ets2蛋白的表達(dá)。

2.3 腫瘤體積及質(zhì)量變化情況 15只裸鼠均荷瘤成功，成瘤率100%，繪制腫瘤生長曲線(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，LV-siEts2組腫瘤體積明顯減小。3組腫瘤平均質(zhì)量分別為(0.65±0.13)、(0.62±0.09)和(0.21±0.06) g(F=5.581，P<0.001)；LV-siEts2組腫瘤平均質(zhì)量明顯低于空白對照組，腫瘤抑制率約為68%，提示LV-siEts2對Eca109具有良好的抑制效果。

1:空白對照組;2:陰性對照組；3：LV-siEts2組。圖2 各組Eca109細(xì)胞中Ets2蛋白的表達(dá)

圖3 腫瘤生長曲線

2.4 腫瘤組織中Ets2的表達(dá)水平 空白對照組、陰性對照組和LV-siEts2組腫瘤組織中Ets2 mRNA相對表達(dá)量分別為(1.00±0.08)、(0.92±0.05)和(0.26±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.088,P=0.002)。與對照組比較，LV-siEts2組腫瘤組織中Ets2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，LV-siEts2組Ets2蛋白的表達(dá)水平也顯著降低，見圖4。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：LV-siEts2組。圖4 各組腫瘤組織中Ets2蛋白的表達(dá)

2.5 腫瘤組織細(xì)胞的凋亡以及黏附相關(guān)蛋白的表達(dá) 空白對照組、陰性對照組和LV-siEts2組細(xì)胞凋亡率分別為(7.20±1.57)%、(8.61±1.45)%和(64.50±7.18)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=162.201，P<0.001)。與對照組相比，LV-siEts2組細(xì)胞凋亡率明顯升高(圖5)。與對照組相比，LV-siEts2組Caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(圖6)。

A:空白對照組;B:陰性對照組;C:LV-siEts2組。圖5 各組腫瘤組織中Eca109細(xì)胞的凋亡(TUNEL,×200)

1:空白對照組;2:陰性對照組;3:LV-siEts2組。圖6 各組腫瘤組織中黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 腫瘤組織中mTOR/p70S6K信號通路蛋白的表達(dá) 與空白對照組相比，LV-siEts2組mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)降低，見圖7。

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：LV-siEts2組。圖7 各組腫瘤組織中mTOR/p70S6K信號通路蛋白的表達(dá)

3 討論

Ets2基因位于人21號染色體上，合成包含496個氨基酸的蛋白質(zhì)[11]，能調(diào)控多個下游靶基因，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等[12]。有研究[7,13]發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中Ets2在mRNA和蛋白水平上均高表達(dá)；人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株SHI-1中Ets2基因高表達(dá)，靶向沉默Ets2基因的表達(dá)可促進(jìn)SHI-1細(xì)胞的凋亡。作者課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，Ets2基因在人食管鱗癌細(xì)胞株EC1、Eca109和EC9706中均高表達(dá)，下調(diào)Ets2基因的表達(dá)能夠抑制EC9706細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。該實驗發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Eca109中Ets2的表達(dá)能抑制腫瘤的生長；檢測LV-siEts2組腫瘤組織中Ets2基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在mRNA和蛋白水平上，其表達(dá)均顯著降低。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白由E-cadherin基因編碼，在維持上皮細(xì)胞表型和黏附連接中起重要作用， E-cadherin表達(dá)的降低或缺失與腫瘤細(xì)胞的黏附、浸潤、遷移以及侵襲密切相關(guān)[14]。Liao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲后，E-cadherin蛋白表達(dá)降低。該研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，LV-siEts2組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，表明下調(diào)Ets2表達(dá)能增強Eca109的黏附能力，抑制遷移和侵襲。該研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LV-siEts2組細(xì)胞凋亡率明顯升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，表明下調(diào)Ets2表達(dá)能促進(jìn)Eca109細(xì)胞的凋亡。

研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，Ets2參與調(diào)控多個信號通路。PI3K通過mTOR/Ets2誘導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄，PI3K/mTOR/Ets2信號通路在癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。體內(nèi)研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織和食管鱗癌組織中mTOR的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且mTOR的表達(dá)水平越高，p70S6K的表達(dá)水平也越高。該研究結(jié)果表明，與對照組相比，LV-siEts2組mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)均顯著降低，Ets2表達(dá)下調(diào)能降低mTOR和p70S6K蛋白的表達(dá)，表明下調(diào)Ets2表達(dá)后可通過調(diào)節(jié)mTOR/p70S6K信號通路的活性抑制腫瘤的生長。

綜上所述，Ets2可能成為食管鱗癌診斷和治療的新型靶點，為食管鱗癌的分子治療提供實驗依據(jù)。

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(2015-10-09收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effect of downregulating Ets2 on tumor growth and mTOR/p70S6K signaling pathway in nude mice xenografted esophageal squamous cell carcinoma

HANKang1),MAShanshan1),LIQinghua1),WANGXinxin2),ZHUXiangzhan1),MENGNan2),HANLi2),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)TheFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Ets2;siRNA;Eca109;nude mice;apoptosis;mTOR/p70S6K signaling pathway

Aim: To observe the effect of downregulating expression of Ets2 on the tumor growth and mTOR/p70S6K signaling pathway in nude mice xenografted Eca109 tumor.Methods: The siRNA which could down-regulate the expression of Ets2 effectively in vitro had been selected before. LV containing the siRNA(LV-siEts2) was established and infected Eca109. Fifteen nude mice were randomly allocated into control group, negative control group and experimental group. Eca109, Eca109 infected by LV and Eca109 infected by LV-siEts2 were inoculated subcutaneously into nude mice to establish transplantation tumor. Later,we observed tumor growth, drawn the tumor growth curve and calculated the tumor inhibition rate. The expression of Ets2 mRNA in tumor tissue was detected by qRT-PCR and cell apoptosis was detected by TUNEL. The protein expression of Ets2,Caspase-3,Bcl-2,E-cadherin and mTOR/p70S6K signaling pathway in tumor tissue was detected by Western blot. Results: The growth rate of tumors in the experimental group slowed down significantly and tumor size and weight was less than the control group and negative control group(P<0.05),besides,the mRNA and protein expression of Ets2 in tumor tissue from the experimental group was reduced significantly. The results of TUNEL demonstrated that LV-siEts2 could significantly induce apoptosis of Eca109 cells(P<0.05). The protein expression levels of Caspase-3 and E-cadherin increased and the protein expression levels of Bcl-2 decreased. In addition, The results of Western blot demonstrated that LV-siEts2 could down-regulate the protein expression level of mTOR and p70S6K significantly. Conclusion: LV-siEts2 could promote cell apoptosis by inhibiting mTOR/p70S6K signaling pathway in vivo, thus inhibiting tumor growth in nude mice xenografted Eca109 tumor.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.002

*國家自然科學(xué)基金項目 81471306，U1404313，河南省高等學(xué)校重點科研項目 15A310028

R735.1