玉米象線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ基因克隆與表達分析

侯昌亮，王靖博，李永強,2，吳 華,2，馬志卿,2，馮俊濤,2，張 興,2

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玉米象線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ基因克隆與表達分析

侯昌亮1，王靖博1，李永強1,2，吳 華1,2，馬志卿1,2，馮俊濤1,2，張 興1,2

（1西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心，陜西楊凌712100；2陜西省生物農藥工程技術研究中心，陜西楊凌712100）

【目的】克隆辣根素可能的作用位點——細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ（COX Ⅲ）的全長cDNA，并對其進行序列分析及原核表達。【方法】在NCBI數據庫中查找玉米象（）COX Ⅲ已知的部分序列，利用RT-PCR，結合RACE技術克隆獲得玉米象COXⅢ全長序列；利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、ProtParam和TargetP 1.1 Server等軟件對該基因全長cDNA序列、系統進化關系、基本理化性質及其三維結構進行分析；將玉米象COXⅢ基因分別與載體Blunt E1、pET28a、pET30a、pET32a、pET42a連接，構建原核表達載體Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分別轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，在不同IPTG誘導濃度、溫度以及時間內誘導融合蛋白表達，采用SDS-PAGE和Western blot（WB）對表達結果進行驗證。【結果】獲得的玉米象COXⅢ基因全長cDNA序列開放閱讀框（ORF）為792 bp，編碼263個氨基酸，編碼的蛋白分子質量約為30 938.1 Da，理論等電點pI 6.51，預測分子式為C1492H2154N338O362S10，不穩定系數為34.49，總平均親水系數為0.492，為疏水的穩定蛋白。系統發育樹顯示玉米象與鞘翅目象鼻蟲科昆蟲米象進化關系最近。原核表達結果表明，該蛋白在18℃、1 mmol·L-1IPTG誘導24 h 的條件下即能實現融合蛋白的表達，可溶性檢測表明該蛋白主要以包涵體的形式存在；Western blot印跡檢測證實大腸桿菌BL21(DE3)中表達了一個分子量約為62 kD的融合蛋白。【結論】成功從玉米象昆蟲克隆得到COXⅢ全長cDNA序列，并實現了其編碼蛋白的原核表達，可為后續探究玉米象COXⅢ功能和異硫氰酸酯類化合物對玉米象的作用機理提供理論依據。

玉米象；細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ；RACE技術；生物信息學；原核表達

0 引言

【研究意義】玉米象（）是一種世界性的儲糧害蟲[1]，也是較難防治的倉儲害蟲之一[2]。目前防治玉米象主要使用化學合成熏蒸劑，如溴甲烷、硫酰氟以及磷化鋁等。2015年，溴甲烷在全球范圍內已被禁用，磷化氫也因長期使用引起嚴重的抗藥性問題[3-4]，因此尋找新型熏蒸劑已成為當務之急。異硫氰酸酯類化合物因其對儲糧害蟲具有極強的熏蒸活性已成為研究開發的熱點，但其作用機理研究較為匱乏。針對辣根素（烯丙基異硫氰酸酯，簡稱AITC）可能的作用靶標玉米象細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ基因進行克隆、序列分析以及原核表達，獲得該化合物作用于玉米象致死的直接證據，可為異硫氰酸酯類生物熏蒸劑作用機制和作用靶標的研究打下基礎，為后續新農藥分子的生物合理設計提供思路。【前人研究進展】線粒體DNA（mtDNA）是動物界細胞核外唯一具有遺傳密碼和蛋白質翻譯系統的遺傳物質，除了參與能量轉換外，還參與4種呼吸酶復合物（13種多肽）的形成[5-6]，其中細胞色素C氧化酶（Cco）是真核生物線粒體內膜和需氧菌細胞膜電子傳遞鏈上的終端金屬膜蛋白酶[7-8]，催化氧分子還原為水，并與質子泵功能相偶聯，具有不同的金屬活性中心。同時承擔著細胞色素C到氧分子的電子傳遞功能，是唯一能將電子傳遞給氧分子的細胞色素，是線粒體氧化能力的關鍵調節部位[9]。所有真核細胞的COX由13個亞基組成，其中構成級聯反應核心的最大3個亞基（COXI、Ⅱ和Ⅲ）由mtDNA編碼，為COX的核心亞基[10]。其余10個亞基（COⅣ、Ⅴa、Ⅴb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc和Ⅷ）均由細胞核DNA編碼。體外實驗動力學研究表明磷化氫是牛心細胞色素氧化酶的非競爭性抑制劑，磷化氫對細胞色素氧化酶的抑制也一直被認為是昆蟲致死的主要原因[11-12]。盡管磷化氫的作用機理仍然有很多爭議，但是線粒體細胞色素C氧化酶被認為是一個主要作用靶標[13]。玉米象成蟲對辣根素與磷化氫有類似的中毒癥狀，其線粒體均有明顯的破壞[14]；蛋白組學研究發現，ITCs能夠與線粒體復合物Ⅰ和Ⅳ結合，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生是一個重要的下游效應[15]。【本研究切入點】辣根素在活體和離體下均對復合體Ⅳ有抑制作用，產生的ROS能夠進一步破壞線粒體膜電位，導致線粒體功能缺陷[16-17]；目前關于COX亞基的研究主要集中在脊椎動物和細菌上的亞基Ⅰ、亞基Ⅱ上[18-19]，關于無脊椎動物玉米象細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ進行原核表達和更進一步的研究尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】利用RT-PCR和RACE技術擴增克隆玉米象COXⅢ序列全長；生物信息學軟件對該基因及其編碼蛋白的結構、性質與功能進行預測；利用不同融合表達策略進行原核表達，為進一步研究其功能及明確異硫氰酸酯類化合物的作用位點提供依據。

1 材料與方法

試驗于2015年7月至2016年6月在西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心完成。

1.1 供試昆蟲

玉米象成蟲由西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心室內人工飼養。小麥置于烘箱（80℃）中消毒2 h，調整含水量至約14%，分裝入罐頭瓶內，接入玉米象成蟲，置于（25±1）℃，相對濕度75%±5%，光周期12L﹕12D的養蟲室內連續飼養7日后篩出成蟲，挑取個頭大小一致試蟲備用。

1.2 主要試劑及工具酶

Primer Script Reverse Transcriptase、RNaseH、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T載體、DL2000 Marker、6×Loading Buffer、限制性內切酶R I、I購自寶生物工程（大連）有限公司；DAB顯色試劑盒、T4 DNA連接酶、蛋白質分子量Marker購自北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）和Transetta（DE3），-Blunt E1購自全式金公司；原核表達載體pET28a、pET30a均為筆者實驗室保存，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；測序由英濰捷基（上海）貿易有限公司完成。其他試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.3 總RNA的提取

用改進后的CTAB法[20]提取玉米象成蟲總RNA。（1）5 mL離心管中加入4 mL CTAB buffer和200 μL-巰基乙醇于65℃預熱；（2）液氮將成蟲玉米象研磨成粉末，迅速將樣品轉移至預熱好的裝有CTAB buffer離心管中，65℃孵育10 min，每2 min渦旋一次；（3）取1 mL分裝到2 mL離心管中，加等體積氯仿-異戊醇混合溶液（氯仿﹕異戊醇=24﹕1），渦旋混勻，冰浴10 min，12 000 r/min、4℃離心15 min；（4）吸取上清液加入新的2 mL離心管中，加等體積氯仿-異戊醇混合溶液，冰浴10 min，12 000 r/min、4℃離心10 min；（5）取上清600 μL，加入200 μL的8 mol·L-1Licl，置于-80℃冰箱沉淀RNA 1 h，12 000 r/min、4℃離心30 min；（6）棄上清，加1 mL 75%乙醇洗滌，7 500 r/min、4℃離心5 min；（7）棄上清，40 μL DEPC-water溶解，-80℃保存備用。

酶標儀檢測RNA溶液的純度和濃度；1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取玉米象總RNA的完整性。

1.4 玉米象COXⅢ全長基因的獲得與驗證

1.4.1 玉米象COXⅢ基因cDNA片段的克隆 根據反轉錄試劑盒HiFi Script Quick gDNA Removal cDNA Kit操作說明，以總RNA為模板反轉錄合成cDNA第一鏈。

根據NCBI中登記的玉米象COXⅢ cDNA的部分已知序列，利用Primer Premier 5（PP5）軟件設計引物，以上述第一鏈cDNA為模板，以cox3 1F、cox3 1R為引物（表1）進行PCR擴增。PCR反應體系：cDNA 1.0 μL，引物cox3 1F和cox3 1R各1.0 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O補足至25 μL。PCR程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，共32個循環；72℃延伸5 min。

表1 玉米象COXⅢ基因克隆所用引物

下劃線為酶切位點，“GAATTC”為R I，“CTCGAG”為I Restriction enzyme cutting sites were underlined.R I (GAATTC),I (CTCGAG)

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經切膠回收后，連接于pMD-19T克隆載體，并轉化感受態DH5中，藍白斑篩選后挑取白色菌落進行菌落PCR，所用引物為M13F（-47）、M13R（-48），鑒定正確后，挑取陽性菌落于5 mL LB液體培養基（含氨芐），在200 r/min，37℃培養12 h條件下，提取質粒，送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序。

1.4.2 細胞色素c氧化酶亞基Ⅲ 3′-RACE擴增 取3.75 μL總RNA為模板，以接頭引物1 μL 3′-CDS PrimerA為反轉錄引物，72℃孵育3 min，42℃ 2 min，離心收集，之后按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual試劑盒說明書，合成3′-RACE的第一鏈cDNA。根據NCBI中亞基Ⅲ部分已知序列，利用軟件Primer Primier 5.0設計3′-RACE擴增特異性引物cox3 1F，反應體系：2.5 μL 3′-RACE cDNA，5 μL下游引物UPM，1 μL上游引物cox3 1F，1 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix，1 μL dNTP Mix，1 μL10×Advantage 2 PCR Buffer，滅菌ddH2O補足至50 μL。PCR程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min，共32個循環；72℃延伸5 min。PCR產物的檢測、純化及測序方法同1.4.1。

1.4.3 細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ 5′-RACE擴增 取2.75 μL總RNA為模板，以接頭引物1.0 μL 5′-CDS PrimerA為反轉錄引物，72℃孵育3 min，42℃ 2 min，離心收集到管底，加入1 μL SMARTerⅡAoligo，之后按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual試劑盒說明書，合成5′-RACE的第一鏈cDNA。利用軟件PP5設計5′-RACE擴增特異性引物cox3 1R（表1），反應體系：2.5 μL 5′-RACE cDNA，5 μL上游引物UPM，1 μL下游引物cox3 1R，1 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix，1 μL dNTP Mix，1 μL10×Advantage 2 PCR Buffer，滅菌ddH2O補足至50 μL。PCR程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共32個循環；72℃延伸5 min。PCR 產物的檢測、純化及測序方法同1.4.1。

1.4.4 細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ全長驗證 利用ContigExpress拼接測序所得的3′-RACE擴增片段和5′-RACE擴增片段以及中間片段；利用在線網站ORF Finder查找開放閱讀框（ORF）；利用PP5在其起始密碼子近5′端和終止密碼子的近3′端設計特異性上游引物qc COX3 1F和特異性下游引物qc COX3 1R（表1），反應體系：1 μL cDNA模板，上下游引物各1 μL，12.5 μL的2×Taq Mix，滅菌ddH2O補足至25 μL，PCR程序：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，共28個循環；72℃延伸5 min。PCR 產物的檢測、純化及測序方法同1.4.1。

1.5 玉米象COXⅢ基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列生物信息學分析

將克隆得到的玉米象COXⅢ序列在NCBI數據庫中Blast驗證，使用ContigExpress軟件拼接得玉米象COXⅢ cDNA 全長序列，利用ORF finder在線軟件查找其開放閱讀框（ORF）；使用DNAMAN對玉米象COXⅢ序列及編碼蛋白進行生物信息學分析，并將其與赤擬谷盜（）、黑盾胡蜂（）、黑腹果蠅（）、紅棕象甲（）、家蠶（）、米象（）6種昆蟲的COXⅢ編碼氨基酸序列進行多重比對。利用MEGA5.1軟件，采取Neighbor-Joining法構建系統進化樹；使用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http://web.expasy.org/ protparam/）預測玉米象COXⅢ編碼氨基酸的基本理化性質；利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）在線工具對玉米象COXⅢ基因編碼蛋白N端信號錨定序列進行預測；TMHMM Server v.1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線工具對玉米象COXⅢ基因編碼蛋白跨膜區進行預測，蛋白質三級結構預測采用SWISS-MODEL。

1.6 玉米象COXⅢ原核表達載體的構建與鑒定

1.6.1 原核表達載體pET系列構建與鑒定 根據玉米象COXⅢ ORF及原核表達載體多克隆位點序列設計含酶切位點的一對引物：COX3 E F1、COX3 E F1（表1）。以基因合成后的片段為模板，PCR擴增，引物為gene cox3 1F、gene cox3 1R（表1），擴增產物經切膠回收、純化后連接到克隆載體pMD19-T。RI和I分別雙酶切重組質粒pMD-19T-COXⅢ和表達載體pET28a、pET30a、pET32a、pET42a，16℃過夜連接。連接產物轉化克隆感受態DH5，菌落PCR鑒定，引物為T7 promoter primer、T7 Terminator Primer（表1），挑陽性克隆提質粒，再次雙酶切鑒定、測序，獲得玉米象的重組表達載體，分別命名為pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ。

1.6.2 原核表達載體PEASY Blunt E1構建 試驗中，針對目的片段COXⅢ分別進行了5個不同載體的構建：-Blunt E1、pET-28a、pET-30a、pET-32a、pET-42a。-Blunt E1和pET系列表達載體不同之處在于：-Blunt E1不含酶切位點，為平滑末端；pET系列表達載體含多克隆酶切位點。對-Blunt E1原核表達載體則設計不含相應酶切位點引物，無需酶切鑒定，其余方法參照pET系列載體構建過程，命名為-Blunt E1-COXⅢ。

1.7 原核表達

鑒定正確的上述重組質粒分別轉化至表達感受態BL21（DE3），挑取含有PEASY Blunt E1-COXⅢ、pET32a-COXⅢ的BL21（DE3）陽性單克隆菌分別于5 mL LB液體培養基（AMP 100 mg·mL-1）；挑取含有pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET42a- COXⅢ的BL21（DE3）單克隆接種到5 mL LB液體培養基中（Kan 50 mg·mL-1），37℃振蕩培養過夜。取適量菌液送生工測序，鑒定目的片段連接是否正確。根據測序結果，取連接正確的單克隆菌菌液以1﹕100（V/V）的比例接種于含有相應抗生素的LB液體培養基中，搖床200 r/min，37℃培養。待OD600為0.6—0.8時，不同溫度、IPTG濃度、時間誘導表達。

1.8 融合蛋白的可溶性及Western blot檢測

誘導結束后，將菌液于4℃ 10 000 r/min離心10 min，收集菌體，稱重，按照1﹕10的比例加入25 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）進行重懸浮，之后再冰上進行超聲破碎，功率300 W，工作8 s，間隔9 s，超聲20 min，超聲后在離心機4℃ 12 000 r/min離心30 min中，分別收集上清和沉淀，再加入4×聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液，水浴煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min。取上清用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并用考馬斯亮藍染色檢測蛋白的表達情況。Western blot印跡雜交驗證目的蛋白的表達。

2 結果

2.1 玉米象COXⅢ cDNA克隆及序列分析

克隆獲得一個玉米象COXⅢ的cDNA全長序列，ORF Finder分析發現該基因含有一個為792 bp，編碼263個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA（圖1）。在NCBI數據庫Blastn發現該序列與米象COXⅢ序列的最高一致性為99%，與其他昆蟲的最高一致性也在75%以上；進一步用ORF翻譯所得的氨基酸序列進行Blastp發現其與其他昆蟲的COXⅢ編碼氨基酸的一致性在70%以上。

劃線標記的ATG和TAA為起始密碼子和終止密碼子The start codon and the stop codon were underlined

2.2 玉米象COXⅢ編碼氨基酸序列比對及分子進化關系分析

應用DANMAN 8.0生物學軟件對玉米象COXⅢ氨基酸序列與其他6種昆蟲的氨基酸序列進行多重序列比對（圖2）。分析表明玉米象COXⅢ與所比對的昆蟲高度同源，同源性達75.23%，其結果與COXⅢ是線粒體其中一個高度保守的核心亞基報道相一致[10]。

T. castaneum：赤擬谷盜Tribolium castaneum；V. bicolor：黑盾胡蜂Vespa bicolor；D. melanogaster：黑腹果蠅Drosophila melanogaster；R. ferrugineus：紅棕象甲Rhynchophorus ferrugineus；B. mori：家蠶Bombyx mori；S. oryzae：米象Sitophilus oryzae；S. zeamais：玉米象Sitophilus zeamais

根據玉米象COXⅢ在NCBI中blastp比對結果，采用MEGA5.0對同源性較高的昆蟲構建玉米象COXⅢ的系統發育樹[21-22]（圖3），系統發育樹顯示玉米象與鞘翅目象鼻蟲科昆蟲米象進化關系最近，相似性為100%；昆蟲COXⅢ編碼氨基酸以目單位各聚為支，其中雙翅目的黑腹果蠅和鱗翅目的家蠶與鞘翅目的進化關系最近，膜翅目的黑盾胡蜂與玉米象COXⅢ氨基酸序列同源性不大，與昆蟲的進化關系相一致。

圖3 玉米象及其他昆蟲COXⅢ氨基酸序列的分子系統進化樹

2.3 玉米象COXⅢ編碼蛋白的基本理化性質預測

利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http://web. expasy.org/protparam/）分析玉米象COXⅢ基因編碼蛋白的基本理化性質，發現該蛋白共包含263個氨基酸，預測分子式為C1492H2154N338O362S10，分子量為30 938.1 Da，理論等電點（pI）為6.51，半衰期為30 h，脂肪指數為106.01，負電荷殘基（Asp+Glu）總電荷為13，正電荷殘基（Arg+Lys）總電荷為10，該蛋白的親水性為0.492，推測為疏水性蛋白。預測蛋白的不穩定參數為34.49，通常認為不穩定參數小于40的蛋白是穩定蛋白，所以此蛋白為穩定蛋白。利用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線工具對玉米象COXⅢ基因編碼蛋白N端信號錨定序列進行預測，發現該蛋白不存在信號肽切割位點（圖4），說明玉米象COXⅢ編碼蛋白為膜結合蛋白。利用TMHMM Server v. 1.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/ TMHMM/）在線工具對玉米象COXⅢ基因編碼蛋白跨膜區進行預測，發現7個跨膜區（圖5）。

C-score：剪切位點值raw cleavage site score；S-score：S值的變化趨勢signal peptide score；Y-score：S值和C值的綜合參數combined cleavage site score每一個氨基酸分別對應一個S值和一個C值，當S值和C值均較高時即為信號肽的位置Each amino acid corresponded to a S value and a C value, respectively. When the value of S and C was higher, the position of signal peptide was the signal peptide

圖5 玉米象COXⅢ基因編碼蛋白跨膜預測

利用在線3D模型構建工具Automatic Modelling Mode（http://swiss model.eapasy.org/）構建三級結構（圖6），三維結構模型顯示玉米象COXⅢ有7個-螺旋，與圖6中7個跨膜區相對應。

圖6 玉米象COXⅢ蛋白的3-D結構預測模型

2.4 原核表達載體的構建和重組子鑒定

生物界中存在不同的編碼系統，線粒體基因編碼與核基因編碼是兩個不同的編碼系統。通過生物信息學軟件分析，按照密碼子的簡并性原則，對COXⅢ基因相應位置堿基置換，基因合成目的片段，構建表達載體，進行原核表達。利用R I和I對重組載體pET系列分別進行雙酶切鑒定，酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，圖7為pET系列4個表達載體雙酶切電泳圖。此外重組子的測序結果與目的序列完全一致，表明玉米象的原核表達載體構建成功。

M：分子量標準DL15000 DNA Marker DL15000；L1：重組表達載體pET28a-COXⅢ經EcoR I和Xho I酶切后的產物The digestion products of pET28a-COXⅢby using restriction enzymes EcoR I and Xho I；L2：重組表達載體pET30a-COXⅢ經EcoR I和Xho I酶切后的產物The digestion products of pET30a-COXⅢby using restriction enzymes EcoR I and Xho I；L3：重組表達載體pET32a-COXⅢ經EcoR I和Xho I酶切后的產物The digestion products of pET32a-COXⅢby using restriction enzymes EcoR I and Xho I；L4：重組表達載體pET42a-COXⅢ經EcoR I和Xho I酶切后的產物 The digestion products of pET42a-COXⅢby using restriction enzymes EcoR I and Xho I

同樣，對重組子-Blunt E1-COXⅢ進行菌落PCR和測序鑒定，測序正確，無堿基的缺失和突變，表明玉米象COXⅢ原核表達載體-Blunt E1-COXⅢ構建成功。

2.5 融合蛋白的可溶性及Western blot檢測

分別對玉米象COXⅢ基因構建的5個不同的表達載體進行融合表達。SDS-PAGE染色、脫色后，BL21（DE3）中的4個表達載體-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ未能在預測分子量33、34、36、51 kD條帶位置處觀察到融合蛋白條帶；進一步通過WB印記雜交驗證、DAB顯色，也未在上述蛋白分子量位置處顯色。從上述SDS-PAGE和Western blot結果可以看出，- Blunt E1-COXⅢ-BL21（DE3）、pET28a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET30a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET32a-COXⅢ-BL21（DE3）4個表達體系未能成功表達出融合蛋白。圖8為4個表達載體中PET30a-COXⅢ重組載體在16℃，轉速200 r/min，誘導24 h后的SDS-PAGE電泳圖。由圖可以看出，重組載體pET30a-COXⅢ誘導后的上清和沉淀，與pET30a空載體誘導相比，并無明顯條帶差異。

M：蛋白分子量標準Protein molecular weight marker；CK：PET30a空載體誘導The supernatant from induced cells containing pET30a；A1—A5：IPTG濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1超聲破碎后上清圖The supernatant from induced cells containing PET30-COXⅢunder 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mmol·L-1；B1—B5：IPTG濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1超聲破碎后沉淀圖The precipitation from induced cells containing PET30-COXⅢunder 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mmol·L-1

在16℃，1 mmol·L-1IPTG誘導24 h條件下，以抗His標簽鼠單克隆抗體（HRP標記）為標簽抗體。根據Western blot顯色結果，5個表達載體中只有pET42a-COXⅢ在BL21（DE3）中成功表達的融合蛋白，蛋白分子量大小為62 kD，與理論預測值相一致，該蛋白主要以包涵體形式存在（圖9）。

M：蛋白分子質量標準Protein molecular weight marker；1：經1 mmol·L-1 IPTG誘導的pET42a-COXⅢ-BL21(DE3)菌體表達蛋白上清The protein supernatant of E. coli BL21 (DE3) carrying pET42a-COXⅢafter induction by 1 mmol·L-1 IPTG；2：經1 mmol·L-1 IPTG誘導的pET42a-COXⅢ-BL21(DE3)菌體表達蛋白沉淀The protein precipitation of E. coli BL21 (DE3) carrying pET42a-COXⅢ after induction by 1 mmol·L-1 IPTG

3 討論

細胞色素C氧化酶是需氧菌細胞膜電子傳遞鏈上和真核生物線粒體內膜的終端酶[7-8]，同時也是磷化氫[11-12]、威百畝[23]、氫氰酸[24]可能的作用靶標。真核生物細胞COX由13個亞基組成，其中最大3個亞基（COXI、II和III）由mtDNA編碼，存在于大多數含heme/copper的終端酶中，所以COXI、II和III通常被稱為核心亞基。本試驗得到玉米象COXⅢ開放閱讀框，利用swiss model在線分析軟件預測后，含有7個跨膜螺旋，與其他文獻報道的細胞色素C氧化酶亞基Ⅲ含有7個跨螺旋一致[25]。盡管亞基Ⅲ存在于幾乎所有的細胞色素氧化酶中，但其具體功能仍不清楚，它既不參與對輔因子的鍵合又非質子泵功能所必需[26]。有文獻報道可能參與細胞色素C氧化酶的裝配[27]或形成氧氣的通道入口以引導到達雙核活性位點[28]。

本研究通過RT-PCR以及RACE技術得到細胞色素C氧化酶的開放閱讀框為792 bp，編碼263個氨基酸，由于線粒體基因組和核基因編碼有兩套不同的編碼系統[29]，例如在無脊椎動物線粒體中TGA編碼色氨酸，在核基因中TGA不編碼氨基酸，為終止子；ATA在無脊椎動物線粒體中編碼甲硫氨酸，在核基因中編碼異亮氨酸。按照目標序列編碼蛋白一級序列的不變性，對獲得細胞色素C亞基Ⅲ基因進行堿基置換，修改完成后，基因合成，構建表達載體，進行原核表達。

對玉米象COXⅢ序列同源相似性搜索結果發現，該序列與其他昆蟲COXⅢ氨基酸序列有較高的同源一致性，可能與COXⅢ是線粒體細胞色素C氧化酶中核心亞基有關，該亞基在長期的生物進化過程中，具有高度保守性[10]。所構建的系統發育樹也出現相似的結果，在COXⅢ氨基酸整個系統發育過程中，同屬鞘翅目的昆蟲玉米象與米象進化關系最近，來自不同目的昆蟲COXⅢ同源性不一，其中鞘翅目與雙翅目、鱗翅目進化關系較近，與鞘翅目的進化關系較遠，由此說明，COXⅢ除了具有相對保守性外，還有一定程度的差異性，從而使得它能在不同物種間行使其獨特的生物學功能。

前期研究表明，玉米象細胞色素C氧化酶為辣根素主要作用靶標[17]。本研究針對玉米象COXⅢ基因構建5個不同表達載體，分別為-blunt EI-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、PET42a-COXⅢ，經雙酶切和測序驗證，目的片段成功連接到表達載體并轉化到表達菌株BL21（DE3）中，目的片段無堿基缺失或移碼突變。對構建好的表達體系-Blunt E1-COXⅢ-BL21（DE3）、pET28a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET30a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET32a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET42a-COXⅢ-BL21（DE3）分別進行原核表達。在-blunt EI-COXⅢ-BL21（DE3）誘導中，以試劑盒中750 bp長度的片段為陽性對照，在不同誘導溫度、IPTG濃度、時間下，未看到目的片段的表達產物，陽性對照表達蛋白大約為30 kD；以相應的空載體表達菌株為陰性對照，pET28a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET30a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET32a-COXⅢ-BL21（DE3）、pET42a-COXⅢ-BL21（DE3），以上述的條件進行表達，只有pET42a-COXⅢ-BL21（DE3）成功表達出帶有6×His標簽和GST tag標簽的融合蛋白，經Western blot印記驗證后在相應的條帶位置顯色，融合蛋白主要以包涵體的形式存在；外源序列在表達感受態細胞中不能表達相應蛋白，影響因素很多，比如宿主菌、載體選擇不合適，具體是何原因還需進一步研究。

4 結論

利用RT-PCR和RACE技術從玉米象體內獲得了COX Ⅲ的全長cDNA序列。生物信息學分析表明COXⅢ具有該基因所編碼蛋白典型生物特性；在pET-42a表達系統中可成功進行該基因所編碼蛋白的原核表達。該研究工作可為后期蛋白質的活性研究以及AITC熏蒸劑對玉米象COX Ⅲ作用機理研究提供理論依據。

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（責任編輯 岳梅）

Cloning and Expression Analysis of Cytochrome C Oxidase Subunit Ⅲ from

HOU Chang-liang1, WANG Jing-bo1, LI Yong-qiang1,2, WU Hua1,2, MA Zhi-qing1,2, FENG Jun-tao1,2, ZHANG Xing1,2

(1Research & Development Center of Bioration Pesticide, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2Research Center of Biopesticide Technology & Engineering, Yangling 712100, Shaanxi)

【Objective】The objective of this study is to clone full-length cDNA of cytochrome C oxidase subunit Ⅲ (COXⅢ), which is a possible action site of allyl isothiocyanate (AITC), then analyze the sequence and prokaryotic expression．【Method】Firstly, finding the known part of the gene of COXⅢ in the NCBI, the full sequence ofCOXⅢ was cloned by RT-PCR and RACE techniques. The sequences of COXⅢ, phylogenetic relationship and properties ofCOXⅢ, the three-dimensional structure were analyzed by a variety of bioinformatics softwares such as DNAMAN8.0, MEGA5.1, GENEDOC, ProtParam and TargetP 1.1 Server. Using-Blunt E1, pET28a, pET30a, PET32a and pET42a as a fused expression vector, a recombinant plasmid-Blunt E1-COXⅢ, pET-28a-COXⅢ, pET30a-COXⅢ, pET32a-COXⅢ, pET42a-COXⅢ were constructed. Then inducing its expression inBL21 (DE3) with IPTG at different concentrations, times and temperatures. SDS-PAGE was used to detect the fusion protein expression and the protein expression was verified by Western blot.【Result】The full-length sequences of COXⅢ fromwas obtained, and its ORF is 792 bp encoding 263 amino acid residues, the predicted molecular weight is 30 938.1 Da, isoelectric point pI is 6.51, the prediction formula is C1492H2154N338O362S10, the unstable factor is 34.49, and the total average hydrophilic coefficient is 0.492. It is a stable hydrophobic protein. Phylogenetic tree showed thathad the closest evolutionary relationship withat the amino acid level. Prokaryotic expression results showed that efficient expression of COXⅢ protein could be realized after induced with 1 mmol·L-1IPTG inBL21 (DE3) for 24 h at 18℃. Solubility analysis showed that the fused protein mainly existed as inclusion bodies. Western blot confirmed that the molecular weight of the recombinant COXⅢ is about 62 kD, consistent with the predicted result.【Conclusion】The full-length sequences of COXⅢ fromwas successfully obtained, and the prokaryotic expression of its encoding protein was achieved, which will lay a foundation for further function research ofCOXⅢ, and provide a theoretical basis for the research of the mechanism of the action on controllingby using isothiocyanates compound.

; cytochrome C oxidase subunit Ⅲ; RACE technique; bioinformatics analysis; prokaryotic expression

2016-08-01；接受日期：2016-09-01

國家自然科學基金（31101457）、西北農林科技大學基本科研業務費專項資金（2452015014）

侯昌亮，E-mail：hou2014050242@nwsuaf.edu.cn。通信作者吳華，E-mail：wgf20102010@nwsuaf.edu.cn