二維液相色譜/雙檢測器法同時測定嬰幼兒配方奶粉、米粉中維生素A、D和E的含量

林玉宙,吳 宏,郭榮爍,鄧義方,黃耀銪,林春霞

(1.明一國際營養品集團有限公司,福建福州 350214;2.齊齊哈爾英頓乳業有限公司,黑龍江齊齊哈爾 161000;3.黑龍江明翔乳業有限責任公司,黑龍江齊齊哈爾 161000)

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二維液相色譜/雙檢測器法同時測定嬰幼兒配方奶粉、米粉中維生素A、D和E的含量

林玉宙,吳 宏,郭榮爍,鄧義方,黃耀銪,林春霞

(1.明一國際營養品集團有限公司,福建福州 350214;2.齊齊哈爾英頓乳業有限公司,黑龍江齊齊哈爾 161000;3.黑龍江明翔乳業有限責任公司,黑龍江齊齊哈爾 161000)

建立了在線二維液相色譜同時快速測定嬰幼兒配方乳品和嬰幼兒米粉中維生素A、D3和E含量的方法。首先,選擇超高效C18柱和聚合鍵合的C18鍵合相PHA柱分別作為一維和二維分離柱,采用反相色譜法在一維上以甲醇、水作為流動相,二維上以乙腈、異丙醇作為流動相。采用四元泵作為一維分析泵,完成維生素A、E的定量和維生素D3的凈化;根據維生素D3在一維色譜柱上的保留時間,確定切割時間窗口并以在線SPE柱收集含有維生素D3的餾分,另一個二元泵將SPE柱中的維生素D3餾分帶到二維色譜柱中,完成維生素D3的定量分析;整個過程由兩套色譜泵帶動的二維色譜系統中運行,過程自動化程度高;只采一個六通閥切換,檢測時間短,只需要10 min就可完全分離所有目標峰。在上述優化條件下測定了嬰幼兒配方奶粉和嬰幼兒配方米粉中3種維生素的含量。通過本方法檢測得到維生素D3的加標回收率為90.1%～99.7%,并與國標方法測定結果進行比較分析,結果表明,維生素A、D3和E偏差均小與<5%。表明該方法簡單、快速、準確。

二維液相,維生素D,嬰兒配方奶粉和米粉,快速測定

根據國家標準中嬰幼兒配方奶粉及米粉營養成分[1-3]有關規定,必須強化的維生素有脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類,其中脂肪溶性維生素包括維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K;維生素A含量約為280～860 μg/100 g,維生素D3含量約為0.5～1.5 μg/100 g,維生素E含量約為2.4～24 mg/100 g。脂溶性維生素通常采用高效液相色譜法進行檢測,由于A、E與D3在奶粉中的含量相差均超過2個數量級,并且樣品基質復雜,同時脂溶性維生素化學性質不穩定,由于溫度、光照、空氣的影響而導致氧化分解[4],而且動物源性食品蛋白脂肪含量高,干擾因素多,奶粉中的維生素多數是經過包被后再添加到食品基質中,所以D3很難定量,傳統分析方法常包括皂化破壁、有機溶劑萃取、濃縮、色譜凈化、正相分離、質譜檢測等步驟[5-11],涉及多次蒸發溶解,操作繁瑣、費時,容易造成待測組分損失,導致測定結果偏低且重現性不好。根椐國標和文獻報道,測定維生素A、D、E、需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器,分別進行凈化制備和分析,前處理過程極其繁瑣,大大影響樣品的分析效率。

1984年Giddings[12]提出多維分離的概念以來,隨著色譜方法的完善、控制及微加工技術的發展,多維分離技術得到較快的發展,,并已在生命科學、環境科學等諸多領域得到應用。近年來,二維色譜分離技術已被越來越多地應用到食品分析中,張艷海[13-14]等開發的在線二維液相色譜法同時測定嬰幼兒和成人配方營養品中的維生素A、D3和E含量的方法,該方法可同時快速、準確測定嬰幼兒及其他配方營養品中維生素A、D3和E含量,提高了樣品分析效率。

本文采用在線二維柱切換-高效液相色譜雙檢測器并聯檢測法,樣品經過皂化、萃取后,直接進樣,以期在液相色譜上實現短時間內分析完成維生素A、D和E,提高方法的準確性和樣品分析效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰配方奶粉(天籟a爾法、天籟寶貝)、幼兒配方奶粉、嬰幼兒配方米粉 均來自明一品牌;氫氧化鉀、無水硫酸鈉、焦性沒食子酸均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司;異丙醇、乙腈、甲醇均為色譜純 美國Fisher公司;實驗用水 超純水;標準品:維生素D3(CAS號:67-97-0,純度:100%) Dr公司;維生素A(CAS號:68-26-8,純度:99.6%) Sigma公司;維生素E(CAS號:10191-41-0,純度:99.9%) Sigma公司;以上標準品 均保存在-20 ℃以下冰箱中。

Agilent1260雙色譜系統 美國Agilent公司(配一個低壓力四元泵、一個高壓二元泵、自動進樣器、帶六路脫氣、兩個二級管陣列紫外檢測器、一個柱溫箱、一個六通閥));色譜柱:waters CORTECS C182.7μm(2.1 mm×100 mm)美國waters公司,Agilent 3.5 μm(2.1×100 mm)美國Agilent公司,Agilent Zorbax SB-C8 5 μm(4. 6 mm×12. 5 mm) 美國Agilent公司;HH-4水浴鍋 國華電器有限公司;RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 柱溫30 ℃;進樣量6 μL。第一維分析泵的流動相:A為甲醇,B為水,流速為0.8 mL/min,第二維分析泵的流動相:A為乙腈,B為異丙醇,流速為0.8 mL/min;檢測波長:維生素A 325 nm,維生素E 296 nm,維生素D3263 nm;梯度洗脫程序見表1。

表1 一維分離和二維分離梯度程序

1.2.2 標準品溶液配制 準確稱取適量維生素A、D3和E標準品,以甲醇溶解并定容至25 mL,制成濃度分別為1.0 g/L的標準品儲備液。取上述標準品儲備溶液適量,分別加甲醇稀釋,制成各標準工作溶液,維生素A:2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/L、維生素D3:0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L、維生素E:50、100、150、200、250 mg/L。

1.2.3 米粉樣品的制備 準確稱取5 g樣品,放入棕色碘量瓶中,加入1 g淀粉酶,再加入30 mL 45～50 ℃的蒸餾水,混合均勻后,用氮氣排除瓶中空氣,蓋上瓶塞,置45 ℃烘箱內30 min。

1.2.4 奶粉樣品的制備 準確稱取5 g樣品,置于棕色碘量瓶中,加30 mL45～50 ℃的蒸餾水。

1.2.5 待測液的制備 在上述棕色碘量瓶中,加50 mL含焦性沒食子酸的無水乙醇溶液,振搖均勻后,加入30 mL KOH溶液,搖勻,90 ℃水浴中回流30 min皂化,皂化完全后,立即置于冰水浴冷卻。冷卻后將樣品轉移到250 mL棕色分液漏斗中,用75 mL石油醚∶乙醚(2∶1)溶液清洗碘量瓶,洗液移入棕色分液漏斗,振搖5 min,靜置分層,下層置于另一棕色分液漏斗,再用75 mL石油醚∶乙醚(2∶1)溶液萃取,合并有機層。用去離子水反復清洗有機層,直至水層至近中性。提取液經10 g無水硫酸鈉脫水過濾至250 mL圓底燒瓶中,40 ℃水浴下氮吹至近干(絕不允許蒸干)后,準確移取4 mL色譜級甲醇溶解,0.22 μm微孔濾膜過濾,上機測定。

2 結果與分析

2.1 二維色譜流路構建和閥切換時間的確定

由于維生素D3含量較低,且樣品基質干擾較大,國標《10769-2010》方法需經過正相制備色譜分離凈化,提取維生素D3的餾分物,再將餾分蒸干定容后,在反相色譜上進行分析[9]。

本文采用二維色譜分離的中心切割法,維生素A、E在配方奶粉中含量較高,樣品經過皂化后,直接在一維色譜柱中實現分離。在一維色譜柱實現初步分離后,將含有維生素D3的餾出物切割至二維色譜柱中進行分離(系統連接方式見圖1)。為了維生素D3的餾出物能夠完全轉移到二維色譜中必須確定切換閥的準確切換時間,開始實驗時將從一維色譜柱進標準品溶液,測定維生素D3的出峰時間、完全洗脫出色譜柱的時間;由于色譜系統、樣液酸堿度、色譜柱的性能等影響,維生素D3在一維色譜分離中的保留時間于每個檢測批次間會有微小波動,因此切割的時間窗太窄容易造成目標物的損失,造成批次間結果偏差;時間窗太寬,會使切換到二維分離柱的溶劑體積過大,對二維分離產生溶劑效應。本實驗通過連續進樣,考察了保留時間波動范圍,確定了最終的切換時間窗口為(4.76～5.06 min),閥切換時間和位置見表2。

圖1 系統聯接圖及分析過程流路圖Fig.1 The diagram of system connection and the flow diagram of analysis process注:左圖一維檢測,中圖維生素D富集,右圖二維檢測。

切換時間(min)閥位置說明01～6一維分析柱進行維生素A、D、E分離，二維色譜柱進行平衡。4 761～2含維生素D的餾分從一維色譜柱切割到富集柱中5 061～6D的餾分富結集結束，二維色譜反向將維生素D沖洗到分析柱中進行分離。

在一維色譜分離中,維生素A和E在10 min即可完成分離,而在二維色譜分離中維生素D3的保留時間為8 min左右,因此方法采用一個六通閥就實現了維生素A、E的與維生素D3的分離,分離后的組分分別進入不同的DAD檢測器,從而實現維生素A、E和D3的同時檢測。由于整個過程單個換閥只要來回切換一次,與采用雙切換閥-單檢測器系統[6-7]檢測時間需要40 min,雙切換閥需要來回切換三次相比有著檢測時間更快系統更穩定的特點。

2.2 二維色譜條件的優化

在二維色譜檢測時,首先要考慮到流動相的兼容性,因此在一維色譜和二維色譜分離中均采用反相色譜法,在流動相選擇上,采用甲醇、乙醇、異丙醇及水這些常用溶劑。在色譜柱選擇上,一維色譜采用CORTECS C182.7 μm超高效色譜柱,采用超高效色譜柱,可以有較地提高分離度,以提高A、D3、E的分離度,使得峰寬變窄,縮短閥切換時間窗口,減少一維色譜中雜質與維生素D3餾分進入二維色譜;二維分離采用Agilent Eclipse PAH3.5 μm色譜柱,對芳香烴類分離較果較好,但對高度相似的成分難以完全分離。在調整流動相比例時,當乙腈與異丙醇比在95∶5時,維生素D3與雜峰重合無法準確定量;當乙腈與異丙醇比在99∶1時維生素D3出峰時間超過10 min,并且色譜峰擴展;最后調整乙腈與異丙醇比例在97.5∶2.5時,維生素D3目標峰與雜質完全分開,峰形對稱,樣品光譜與標品光譜一致性高(色譜、光譜圖見圖2)。

圖2 0.15 mg/L維生素D標準品、樣品色譜圖及光譜圖Fig.2 The chromatograms and spectra of 0.15 mg/L vitamin D standard and sample注:圖中A:標準品、B:樣品。

2.3 方法線性范圍、儀器定量限、精密度考察

分別量取維生素D3、維生素A和E的標準工作溶液適量,至10 mL棕色量瓶中,制成系列混合標準品溶液;結果顯示,維生素A在2.5～12.5 mg/L 范圍內的相關系數r為0.9999,維生素E在50～250 mg/L范圍內的相關系數r為0.9999,維生素D3在0.05～2.5 mg/L 范圍內的相關系數r為0.9997,表明各目標物線性關系很好。按S/N=10確定目標物的定量限,維生素A的定量限為 0.023 mg/L;維生素E的定量限為0. 880 mg/L;維生素D3的定量限為0. 0053 mg/L。

表3 樣品中維生素A、E及D3的含量及其加標回收率(n=3)

表4 本方法與國標檢測方法樣品檢測結果的偏差

取0.05 mg/L維生素A、D3、E的混合標準溶液連續進樣10次,計算得到維生素A、E和D3峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.91%、0.97%和1.05%。結果表明該方法在連續進樣時精密度較好。

2.4 實際樣品檢測及回收率的測定

準確稱取5 g嬰幼兒配方奶粉和配方米粉及調制粉樣品,在樣品號為1的樣品中加入標準品A、D3、E的量分別為5、0.10、100 mg/L,在樣品號為2的樣品中加入標準品A、D3、E的量分別為7.5、0.15、150 mg/L,在樣品號為的3樣品中加入標準品A、D3、E的量分別為10、0.20、200 mg/L;按照2.7節所述實驗方法制備樣品溶液,測定3種維生素的含量,計算回收率。結果顯示,維生素A 的加標回收率為93.1%～101.5%;維生素E的加標回收率為91.7%～103.0%;維生素D3的加標回收率為90.1%～99.7%,結果見表3。

2.5 本方法與國標檢測方法樣品檢測結果對比

采用本方法測定嬰幼兒配方奶粉1至3段維生素A、D3、E的結果,與國標檢測方法進行比對結果及相對偏差見表4,維生素A的檢測結果與國標法的偏差<1%,維生素E<5%、維生素D3<4%。結果表明采用該方法檢測的結果與國標法檢測結果一致性較高,可以應用與實際的樣品檢測。

3 結論

本文基于現有的在線二維液相色譜分離技術[13-14],另外構建了采用一個六通閥,兩個檢測器的檢測體系的新系統連接方式,同時測定嬰幼兒配方乳品、強化乳品中維生素A、D3、E的分析方法,采用該體系有檢測速度快、壓力波動小、體穩定的特點。本文與文獻[13-14]相比,只采用一個六通閥切換,避免了雙三元系統采用兩個六通切換閥時,當一維分離時維生素D3餾分時間窗口發生輕微的改變就必須更改多個閥切換時間的問題;采用兩個檢測器,維生素A、E與維生素D3在不同的檢測器進行檢測,兩個檢測器間互不干擾,避免了采用一個檢測器的系統必須等A、E流路中的雜質完全流出后才進行維生素D3檢測的缺點;檢測時間更短,只需要10 min就可完全分離所有的目標峰。本文采用在線二維液相色譜分離技術測定奶粉、米粉中的維生素A、D3、E,縮短了分析時間,減少溶劑消耗、降低多閥切換時間、提高了系統穩定性,為測定嬰幼兒及其他配方營養品中維生素A、D3 和E含量提供了一個新的思路。

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[2]中華人民共和國衛生部.GB10767-2010食品安全國家標準-嬰幼兒配方食品[S].北京:中國標準出版社.

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Simultaneous determination of vitamin A,D and E in infant formula milk powder and rice flour by two-dimensional liquid chromatography/double detector

LIN Yu-zhou1,WU Hong1,GUO Rong-shou1,DENG Yi-fang2,HUANG Yao-you3,LIN Chun-xia1

(1.Wissun International Nutrition Group Co.,Ltd.,Fuzhou 350214,China;2.Qiqihaer Yingdun Dairy Industry Co.,Ltd.,Qiqihaer 161000,China;3.Heilongjiang Mingxiang Dairy Industry LLC,Qiqihaer 161000,China)

The aim was to establish a simultaneous determination method for infant formula milk powder and infant rice in vitamin A,D3and E using line two-dimensional liquid chromatography. At first,to choose Ultra-efficient C18and C18bonded polymeric bonded phase column PHA used as one-dimensional and two-dimensional separation column separately. One dimension with methanol and water acted as the mobile phase by reverse-phase chromatography method,and the two-dimension with acetonitrile and isopropanol as the mobile phase. Detection wavelength of vitamin D3,vitamin E and vitamin A separately was 263,296 and 325 nm. Using Quaternary LC pump as a one-dimensional analysis,complete quantitative of vitamin A,E and purification of vitamin D3. The other two binary pumps put vitamin D3fraction in SPE column to a two-dimensional chromatographic column and to complete quantitative analysis of vitamin D3. Run the entire two-dimensional chromatographic system consists of two pumps driven chromatography with high degree of automation,only a six-way valve was switched,and the detection time was short,only 10 minutes to complete separation of all the peaks. 3 kinds of vitamins of infant formula and infant formula rice were detected under these optimal conditions. The standard addition recovery of vitamin D3by this method was 90.1% to 99.7%. And the measured results were compared with the national standard method that suggest that vitamin A,D3and E deviations were small and<5%. It was showed that the method was simple,fast and accurate.

Dimensional liquid;vitamin D;infant formula and rice flour;rapid determination

2015-01-04

林玉宙(1978-),碩士,研究方向:食品安全與營養成份檢測,E-mail:linyuzh@qq.com。

福州市企業自主創新計劃(2014-G-7)。

TS252.7

B

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000