補腦軟膠囊對血管性癡呆小鼠學習、記憶能力和海馬組織的影響*

李喜香，潘從澤，王建良，李季文，畢映燕，張亞會，錢夢茹

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730020； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

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·實驗研究·

補腦軟膠囊對血管性癡呆小鼠學習、記憶能力和海馬組織的影響*

李喜香1，潘從澤2，王建良2，李季文2，畢映燕2，張亞會2，錢夢茹2

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730020； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

目的：觀察補腦軟膠囊對血管性癡呆小鼠模型的學習、記憶能力和海馬組織的影響。方法：采用反復加閉雙側頸總動脈方法制備血管性癡呆小鼠模型。將造模成功的小鼠隨機分為假手術組,模型對照組,補腦軟膠囊高、中、低劑量組和尼莫地平組6組。給藥第20天進行用跳臺實驗檢測小鼠學習和記憶能力；給藥第28天取小鼠海馬組織進行HE染色，觀測CA1區(qū)的組織病理學改變。結果：學習成績方面，各給藥組與模型對照組對比，學習反應時間均縮短，錯誤次數均減少，差別有統計學意義(P<0.01)；補腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，反應時間縮短，錯誤次數減少，差別有統計學意義(P<0.05)。記憶成績方面，各給藥組與模型對照組對比，潛伏期時間均延長，錯誤次數均減少，差別有統計學意義(P<0.05)；補腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，潛伏時間延長，錯誤次數減少，但差別無統計學意義(P>0.05)；補腦軟膠囊高劑量組與低劑量組對比，錯誤次數減少，差別有統計學意義(P<0.05)。各給藥組均可減輕海馬組織CA1錐體細胞的損傷，補腦軟膠囊高劑量組優(yōu)于尼莫地平組。結論：補腦軟膠囊能夠改善血管性癡呆小鼠的學習、記憶能力，減輕海馬組織損傷，對血管性癡呆小鼠有一定的治療作用。

補腦軟膠囊/藥效學；跳臺實驗；學習記憶；海馬病理；動物；小鼠

血管性癡呆(vasculardementia，VD) 是各種腦血管病變引起的獲得性智能損害和認知障礙的綜合征，是一種慢性進行性疾病，表現為記憶、計算、定向、判斷能力下降，可伴有情感障礙、行為異常、認知功能障礙和相關腦血管病的神經功能障礙[1]。如何改善和提高VD患者的學習、記憶能力，已成為醫(yī)藥領域的研究熱點之一。補腦膏(批準文號甘藥制字Z04000828)是甘肅省中醫(yī)院院內制劑。近30a的臨床實踐證實，其對腦外傷性神經損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，脊髓變性等腦部疾病療效確切，同時對血管性癡呆的治療和預防有明顯的臨床效果[3-4]。補腦軟膠囊是在補腦膏原處方基礎上，運用現代技術研制而成。本實驗將補腦軟膠囊內容物作用于血管性癡呆小鼠模型，探討其療效及部分作用機制，從而為補腦軟膠囊的臨床用藥提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康SPF級KM小鼠，雄性，體質量22～25g，由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

補腦軟膠囊由川芎、當歸、黃芪、枸杞子、黃精、仙茅、淫羊藿等藥物組成，將浸膏粉加入大豆油基質、潤濕劑司盤-80、助懸劑蜂蠟、助流劑微粉硅膠，1g內容物含浸膏粉0.48g；尼莫地平片，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產品，批號B140901015；注射用硝普鈉，湖南科倫制藥有限公司產品，批號B14050503。水合氯醛，天津市大茂化學試劑廠產品，批號20141013；40g/L多聚甲醛，北京索萊寶科技有限公司產品，批號20141223。DT200小鼠跳臺測試儀，成都泰盟科技有限公司產品；TEC-VEMJ2 全自動組織包埋機、VIP-5Jr-J2自動組織脫水機、IVS-410石蠟切片機，均為日本SakuraFinetekJapanCo.Ltd產品；Bio-Rad680多功能酶標儀，美國伯樂公司產品；OlympusCKS41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；SIGMA3-18K低溫高速離心機，德國希格瑪公司產品。

1.3 模型的建立與動物分組

60只小鼠按體質量隨機分為假手術組(生理鹽水10μL/g)、模型對照組(生理鹽水10μL/g)、補腦軟膠囊高劑量(800μg/g)組、補腦軟膠囊中劑量(400μg/g)組、補腦軟膠囊低劑量(200μg/g)組和尼莫地平組(尼莫地平14μg/g)6組，每組10只。術前12h禁食、不禁水；以水合氯醛(500μg/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定于手術臺上，常規(guī)消毒，頸部正中切口；分離雙側頸總動脈(CCA)；在夾閉雙側CCA之前，腹腔注射硝普鈉(2.5μg/g)，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側CCA10min；再通10min；再夾閉10min；再通后縫合切口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術組僅分離雙側CCA，不夾閉雙側CCA，不注射硝普鈉[5-6]。術中小鼠肛溫保持在36.5～37.5 ℃之間。術后連續(xù)3d肌肉注射青霉素以預防感染。各組手術后第1天均以灌胃方式給藥(按體質量10μL/g)，連續(xù)給藥28d，1d1次。藥物均精密稱定，以滅菌后的生理鹽水配置為混懸液。

1.4 檢測指標

1.4.1 跳臺實驗

灌胃第20天進行跳臺實驗，將小鼠置于反射箱內適應5min后輕放于平臺上，小鼠在平臺的停留時間為潛伏期。小鼠從平臺跳下、接觸銅柵視為錯誤，將受到電刺激后跳回平臺以躲避傷害性刺激視為正常反應。記錄小鼠首次受到電刺激跳回平臺所需時間(即反應時間)、跳下安全臺次數(即錯誤次數)作為學習成績。于訓練后24h進行測驗，記錄第1次跳下平臺的潛伏期、5min內的錯誤次數作為記憶成績[7]。

1.4.2 組織病理學

灌胃第28天進行小鼠海馬部位取材。用冰的生理鹽水進行心臟灌注后，分離兩側小鼠海馬組織，一側海馬組織以40g/L多聚甲醛進行固定，洗滌，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，貼片，烤片，二甲苯脫蠟及水化，HE染色，封片等，采用光學顯微鏡(200倍)觀察海馬組織的變化。每個標本連續(xù)切片5張，切片厚度4μm。正常海馬組織形態(tài)為CA1區(qū)錐體細胞分4層排列，排列整齊，形態(tài)完整，層次分明；胞質均質染色，核大而圓，胞核無固縮；纖維結構清晰可辨，未有淋巴細胞浸潤[8～9]。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 各組小鼠學習成績和記憶成績對比

學習成績：與假手術組對比，模型對照組小鼠的反應時間延長，錯誤次數增加，差別有統計學意義(P<0.01)，表明小鼠的學習成績下降。與模型對照組對比，各治療組反應時間均縮短，錯誤次數均減少，差別有統計學意義(P<0.05)。補腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，反應時間縮短，錯誤次數減少，差別有統計學意義(P<0.05)；與中、低劑量組對比，反應時間均明顯縮短，差別有統計學意義(P<0.05)。結果表明：各治療組均能提高血管性癡呆小鼠跳臺實驗學習能力，且在改善反應時間方面補腦軟膠囊呈量效關系。

記憶成績：與假手術組對比，模型對照組小鼠的潛伏時間縮短，錯誤次數增加，差別有統計學意義(P<0.01)，表明記憶成績下降。與模型對照組對比，各治療組潛伏時間均延長，錯誤次數均減少，差別有統計學意義(P<0.01)。補腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平對照組對比，潛伏時間延長，錯誤次數減少，但差別無統計學意義(P>0.05)；與低劑量組對比，錯誤次數減少，差別有統計學意義(P<0.05)。結果表明：各治療組均可提高血管性癡呆小鼠跳臺記憶成績，且在增加潛伏時間方面有量效關系的趨勢。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)學習成績(灌胃第20天)反應時間/s錯誤次數/次記憶成績(灌胃第21天)反應時間/s錯誤次數/次假手術組15.06±5.04**2.50±1.20**165.88±18.06**2.70±1.44模型對照組53.94±11.577.60±2.5280.14±21.407.80±2.40補腦軟膠囊高劑量組80024.42±5.40**##△**4.30±1.56**#△150.95±20.49**△△4.10±1.32*補腦軟膠囊中劑量組40030.36±5.04**5.20±1.60*135.77±30.09**5.60±2.28補腦軟膠囊低劑量組20035.21±7.97**6.30±1.36139.49±38.63**5.90±1.88尼莫地平組1433.11±8.77**5.70±1.50123.92±21.68**5.10±1.54*

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與補腦軟膠囊低劑量組對比，#P<0.05，##P<0.01;與尼莫地平組對比，△P<0.05，△△P<0.01；與補腦軟膠囊中劑量對比，＊＊P<0.01。

2.2 各組小鼠海馬組織CA1區(qū)組織病理學改變

光鏡下，假手術組海馬CA1區(qū)錐體細胞分4層排列，排列整齊，形態(tài)完整，層次分明；胞質均質染色，核大而圓，胞核無固縮；纖維結構清晰可辨，未見淋巴細胞浸潤。模型對照組海馬CA1區(qū)錐體細胞數量明顯減少，排列散亂，層次不清；局部可見淋巴細胞浸潤；部分錐體細胞明顯受損，胞漿內可見空泡形成，細胞核固縮，纖維結構零亂不清。各治療組海馬CA1區(qū)錐體細胞輕度損傷或者損傷不明顯，未見錐體細胞數量明顯減少；局部細胞排列紊亂，纖維結構略零亂、不清晰；局部錐體細胞可見胞漿空泡形成。其中補腦軟膠囊高劑量組小鼠海馬 CA1區(qū)有少量脫失的錐體細胞，少數細胞核固縮，錐體細胞纖維排列較為整齊；中、低劑量組小鼠海馬 CA1區(qū)錐體細胞部分脫失，部分細胞核固縮為三角形或多角形；尼莫地平組海馬CA1區(qū)錐體細胞損傷不明顯，未見錐體細胞數量明顯減少，局部細胞排列紊亂、纖維結構零亂、不清晰，局部少量錐體細胞可見胞漿空泡形成。結果表明：藥物對海馬組織細胞起到了保護作用，補腦軟膠囊高劑量作用優(yōu)于尼莫地平。見圖1。

A.假手術組;B.模型對照組;C.補腦軟膠囊高劑量組;D.補腦軟膠囊中劑量組;E.補腦軟膠囊低劑量組;F.尼莫地平組

3 討 論

跳臺實驗通過記錄實驗小鼠到安全平臺的時間和受到電擊的次數來反映實驗動物尋找安全平臺的空間認知能力和學習記憶能力[8]。本研究結果表明：補腦軟膠囊對VD小鼠的學習記憶有一定的改善作用，與模型對照組對比，高劑量組反應時間、潛伏時間、錯誤次數均有顯著性差別，中、低劑量改善作用相對較弱，有明顯的量效關系趨勢，呈劑量依賴性。海馬是與認知功能密切相關的重要腦區(qū)，是學習、記憶的高級中樞之一，直接參與信息的整合與貯存；是空間學習記憶能力的關鍵結構，損害海馬則影響空間學習記憶；因此，選擇海馬作為研究學習、記憶能力的主要部位，有著極其重要的意義。腦組織中海馬區(qū)對缺血、缺氧最為敏感，其中海馬CA1區(qū)是海馬中最易受損的區(qū)域。急、慢性腦血管病變后海馬CA1區(qū)細胞明顯受損，伴隨記憶力明顯下降。海馬組織中神經元的存活數量直接影響神經元突觸的可塑性效應，影響信息的整合、儲存和傳遞。因此，急、慢性腦血管病變后腦組織缺血、缺氧導致海馬CA1區(qū)錐體細胞遲發(fā)性壞死，神經元的大量凋亡丟失，可能是患者腦卒中后發(fā)生 VD 的病理學基礎[9-11]。本實驗結果顯示：補腦軟膠囊高、中、低劑量組和尼莫地平組海馬CA1區(qū)錐體細胞輕度損傷或者損傷不明顯，未見錐體細胞數量明顯減少。結果表明：補腦軟膠囊對VD有一定的改善作用。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2016)11-0067-04

R749.1+

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.11.28

李喜香(1968-)，女(漢族)，甘肅秦安人，主任中藥師，碩士研究生導師，主要從事中藥制劑工藝研究。

蘭州市科技計劃(2012-2-78)

2016-05-16；

2016-09-06