超高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留

楊衛軍，李　曼，曹秀梅，林艷青

（河北省秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心，河北　秦皇島　066000）

超高效液相色譜法檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留

楊衛軍，李曼，曹秀梅，林艷青

（河北省秦皇島市農產品質量安全監督檢驗中心，河北秦皇島066000）

本研究建立了檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物的超高效液相色譜分析方法，樣品采用磷酸鹽緩沖溶液提取，提取液經Bond Elut C18固相萃取柱富集凈化，在熒光檢測器下進行定性與定量分析。結果表明，該方法對4種氟喹諾酮類藥物在0.000 2～0.5 g/m L范圍內呈良好的線性關系，相關系數（r2）均大于0.999 8，在3個添加水平范圍內的回收率為67.6%～97.1%，相對標準偏差為3.1%～5.4%，方法檢出限為3 g/kg，定量限為10 g/kg。

超高效液相色譜法；氟喹諾酮類；雞肉；殘留

氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones,FQs）是感染性疾病的治療藥物，但由于其具有促進動物生長、改善動物產品品質、降低動物發病率及死亡率等作用，常被作為飼料添加劑用于飼料中[1-4]。該類藥物的濫用以及使用后未嚴格實行休藥期制度，常常導致其在動物性食品中的殘留超標。農業部235號公告規定了雞肉中達氟沙星、恩諾沙星和沙拉沙星的最高殘留限量分別為200、100和10μg/ kg。人們如果長期食用殘留超標的動物性食品，就會對人體造成一系列不同程度的毒副作用，如對人體的中樞神經系統及心血管系統造成不良反應，甚至致癌[5-8]。

目前，雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留檢測采用高效液相色譜法，該方法檢測耗時長，檢測效率低。隨著超高效液相色譜檢測技術的出現，已經應用到各個領域，該技術與傳統的HPLC相比，在速度、靈敏度和分離度方面大大提高，它不僅縮短了分析時間，同時也減少了溶劑用量，降低了分析成本，提高了工作效率。本文借鑒農業部現行有效標準動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測-高效液相色譜法（農業部1025號公告-14-2008）中的前處理方法及檢測過程，建立了雞肉樣品中4種氟喹諾酮類藥物殘留的超高效液相色譜快速測定方法，為雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留檢測提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑雞肉（去除脂肪），采自農貿市場；環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星標準品（純度均≥99%，中國獸醫藥品監察所）；乙腈（HPLC級，美國Fisher公司）；甲酸（色譜純，Dikmapure）；其他試劑均為優級純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；試驗用水為經Mil l i-Q凈化系統過濾的去離子水；Varian BondElut C18固相萃取柱（100 mg/mL，安捷倫科技有限公司）。

1.2儀器與設備ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Mi l l i-Q超純水器（美國Mil l ipore公司）；TGL-20M臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；漩渦混合器XW-80A（上海青浦扈西儀器廠）；超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；AY-5多用調速振蕩器（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；GX-274自動固相萃取儀（美國吉爾森公司）。

1.3色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱溫30℃；檢測波長：激發波長280 nm，發射波長450 nm；流動相為0.1%甲酸：乙腈（v:v）=86:14；流速0.35 mL/min；進樣體積5μL。

1.4樣品提取與凈化稱取絞碎試樣2.00 g，加入10.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），在振蕩器上中速振蕩5 min后，以12 000 r/min離心5 min，移取上清液至另一離心管中；向殘渣中加入10.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），重復上述操作一次，合并上清液。固相萃取柱的活化：依次用甲醇、磷酸鹽緩沖溶液各2.0 mL淋洗；取5.0 mL上清液進行上樣；用水1 mL淋洗，并擠干；最后用1.0 mL流動相洗脫，擠干，收集洗脫液，流速均控制在1.0 mL/min。洗脫液最后過0.22μm混合微孔濾膜，上機進行測定。

1.5標準曲線的繪制準確稱取4種氟喹諾酮類藥物標準品，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容，用流動相將環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星都分別稀釋成0.001、0.010、0.050、0.100、0.300和0.500μg/mL，達氟沙星稀釋濃度為0.0002、0.002、0.010、0.020、0.060和0.100μg/mL，采用超高效液相色譜測定。以各組分的色譜峰面積對濃度做線性回歸方程并繪制標準曲線，采用向空白樣品中添加不同濃度標準溶液進行檢測，根據色譜圖信噪比計算方法的檢出限和定量限。

1.6方法學驗證通過對樣品添加回收率試驗進行方法學驗證，驗證的效能指標包括回收率、精密度。向空白雞肉樣品中添加不同濃度的氟喹諾酮類標準溶液，做添加回收試驗，使其樣品添加濃度為10、50和100μg/kg，每個濃度做3個平行試驗。

2　結果與討論

2.1色譜分離條件的優化由于FQs中含有羧基和可質子化的氮，屬于兩性化合物，在流動相的選擇上多采用磷酸鹽緩沖溶液或經乙酸調pH的水溶液，然而，通常僅調節pH的情況下，C18柱上不能得到良好分離，普遍存在出峰過早、標準品之間分離不完全、峰拖尾等情況。有文獻報道多采用磷酸/三乙胺、磷酸鹽/四丁基溴化銨等以改變FQs的保留因子并抑制色譜峰拖尾。由于超高效液相色譜儀的管路較常規液相色譜儀的管徑細，且鹽溶液容易析出并堵塞管路，影響正常檢測，因此經過試驗，最終流動相確定為0.1%甲酸:乙腈（v:v）=86: 14，亦可以得到良好的峰形和分離度，采用等度洗脫方式6 min之內就可以實現對4種FQs的分離檢測，見圖1。而高效液相色譜法的檢測時間大概需要25 min，與普通高效液相色譜法相比，該方法大大縮短了檢測時間，高效液相色譜圖如圖2。

2.2標準曲線、檢出限和定量限環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星在濃度0.001～0.5μg/mL，達氟沙星在濃度0.000 2～0.1μg/mL范圍內4種氟喹諾酮類藥物的峰面積（Y）與濃度（x）呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999 8（見表1）。向空白樣品中添加不同濃度的FQs標準溶液進行檢測，當添加環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的濃度為3μg/kg時，色譜圖信噪比約等于3，此時的方法檢出限為3μg/kg：當添加環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星的濃度為10μg/kg時，色譜圖信噪比大于10，此時的方法定量限為10μg/kg。

2.3回收率試驗精密稱取2.00 g空白樣品，向其中添加不同濃度的混合標準儲備液（添加濃度分別為10、50和100μg/kg），按試驗方法測定含量，平均回收率為67.6%～97.1%，相對標準偏差（RSD）為3.1%～5.4%，見表2，樣品空白和樣品添加色譜圖如圖3和圖4所示。

圖1　4種氟喹諾酮類藥物混合標準樣品的色譜圖Fig.1　Chromatogram of standard samp les from fluoroquinolones

圖2　4種氟喹諾酮類藥物混合標準樣品的色譜圖Fig.2　Chromatogram o f standard sam ples from fluoroquino lones

表1　4中氟喹諾酮類藥物線性方程和相關系數Tab le1　Linear relationship and corre lation coe fficient of fluoroquinolones

表2　4種氟喹諾酮類藥物的回收率和相對標準偏差Table2　Recoveries and relative standard deviations of fluoroquinolones

圖3　雞肉空白樣品色譜圖Fig.3　Chromatogram of samp les from chicken

圖4　雞肉中添加4種氟喹諾酮類藥物色譜圖Fig.4　Chrom atogram from sam p les of spiked levels

3　結論

本文建立了一種同時測定雞肉中4種殘留的FQs超高效液相色譜檢測法（UPLC）。與普通液相法比較，該方法全面提升了液相色譜的檢測速度、靈敏度和分離度，重現性好、穩定性高，大大縮短了分離時間，能夠滿足對雞肉組織中FQs殘留分析的要求，同時減少了溶劑用量、降低了分析成本，有效地提高工作效率。

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Discussion on Determ ination of Fluoroquinolones Residues in Chicken by Ultra-performance Liquid Chromatography

Yang Wei jun,Li Man,Cao Xiumei,Lin Yanqing
(Qinhuangdao Agricul tural Product Quality Safety Supervision and Inspection Center,HebeiQinhuangdao066000)

An ul tra high per formance l iquid chromatographic(UPLC)method for determination of f luoroquinolones residues in Chicken has been developed,Samples were extracted by phosphate buffer solution.Ext ract was enriched and puri fied in Bond Elut C18,Qual itative and quantitative analysis on the f luorescence detectors were car ried out.The resul ts show that f luoroquinolones has good linear relationship between 0.000 2～0.5μg/mL.The cor relation coef f icient was r2＞0.999 8.The average recovery at the three spiked levels was in the range of 67.6%to 97.1%.The relative standard deviations were f rom 3.1%to 5.4%.The l imits of detection for f luoroquinolones were 3μg/kg.The l imits of quanti f ication were 10μg/kg.

UPLC;Fluoroquinolones residues;Chicken;Determination

S859.84

B

1672-9692(2016)04-0008-05

2016-03-09

楊衛軍（1981-），男，河北秦皇島人，碩士研究生，獸醫師，主要從事農產品質量安全檢測工作。