精氨酸剝奪治療在肝細胞癌中的研究進展

陳潔 曾慶磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江

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·綜 述·

精氨酸剝奪治療在肝細胞癌中的研究進展

陳潔 曾慶磊 李晶晶 胡秋月 余炎 余祖江

肝細胞癌是全球第六常見的惡性腫瘤，占惡性腫瘤死因的第三位[1]。據統計：中國每年新患肝癌人數為46.61萬，每年死亡人數為42.21萬[2]。肝癌的主要病因有病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉素、化學致癌物和環境因素等[1]。治療方法主要是肝切除術、經導管動脈化療栓塞、射頻消融術(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)和肝移植。索拉非尼是晚期肝癌患者全身化療的一線用藥，只能延長患者生存時間3個月左右。

隨著腫瘤分子生物學研究的深入，發現腫瘤有其特殊的生理學特性。譬如，精氨酸是半必需氨基酸，正常細胞可攝取外源性精氨酸，也可從頭合成精氨酸。一些腫瘤，特別是肝細胞癌，精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)是缺陷的，使得精氨酸代謝障礙，而完全依賴于外源性精氨酸來支持必需的生物過程，即精氨酸營養缺陷型。研究發現精氨酸剝奪治療在肝癌中有一定效果，本文就精氨酸剝奪治療在肝細胞癌中的研究進展進行如下綜述。

一、精氨酸的生物化學及在腫瘤中的作用

精氨酸是尿素循環中鳥氨酸的上游產物。經鳥氨酸氨甲酰氨基轉移酶(OTC)催化，鳥氨酸轉化為瓜氨酸。瓜氨酸由ASS1和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)催化而生成精氨酸。精氨酸酶水解精氨酸為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸再次進入尿素循環。精氨酸也可在一氧化氮合酶催化下產生一氧化氮(NO)和瓜氨酸，還可由鳥氨酸生成多胺類(圖1)。

精氨酸參與多種細胞代謝過程，可促進傷口愈合，促進多種激素釋放，并有免疫調節活性等。1930年，ESM1R等發現了精氨酸促進腫瘤生長的作用。無論對于原發還是種植產生腫瘤的小鼠，精氨酸喂養都促進其腫瘤生長[3]。同時，精氨酸是多胺類的前體，這被證明促進了腫瘤的生長、轉移、侵襲[4]。另外，精氨酸是NO的唯一底物，NO可通過血管內皮生長因子促進腫瘤血管生成，并可調控腫瘤細胞DNA的破壞及修復，還可通過caveolin-1來調控腫瘤細胞侵襲行為等[5]。

注：①OTC；②ASS1；③ASL；④精氨酸酶。Ⅰ氨基甲酰磷酸合成酶2；Ⅱ門冬氨酸氨基甲酰轉移酶；Ⅲ二氫乳清酸酶。

圖1 尿素循環和嘧啶從頭合成的關系及精氨酸剝奪治療途徑

注：[1]未提供，[2]陽性相關，[3]陰性不相關

二、ASS1在腫瘤中的重要作用

肝癌中缺乏ASS1[6](表1)。ASS1缺失由ASS1基因啟動子甲基化造成，并被認為促進了腫瘤增殖、侵襲、遷移[11][15]。例如檢測149位乳腺癌患者腫瘤組織中ASS1表達情況時發現，ASS1陰性占63.8%(95/149)[16]。用shASS1敲除ASS1基因則促進了乳腺癌細胞增殖和侵襲[16]。體外實驗重新引入ASS1抑制了腫瘤血管生成、腫瘤增殖和遷移，表明ASS1可能是一種新型的腫瘤抑制因子[22]。

三、精氨酸剝奪抑制肝癌細胞生長的機制

機制尚不明確。研究發現精氨酸剝奪抑制多種腫瘤細胞生長，可能機制總結如下：(1)直接影響蛋白質合成，特別是富精氨酸核組蛋白合成。(2)誘導細胞凋亡。精氨酸剝奪通過調節Cyclin和CDK導致了肝癌細胞G2/M期停滯和caspase依賴的凋亡[23]。(3)誘導細胞自噬。精氨酸剝奪可通過溶酶體氨基酸轉運體SLC38A9抑制mTORC1途徑而誘導自噬[24]。前列腺癌中精氨酸剝奪抑制mTOR信號通路，說明它也可能誘導自噬。(4)抑制血管生成。ADI在體外實驗中抑制人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移，體內實驗中抑制腎癌腫瘤血管生成[17]，這可能與ADI調控細胞外精氨酸水平來抑制NO合酶而導致NO下調有關(圖2)。

四、精氨酸剝奪的途徑

基于上述機制，精氨酸剝奪治療肝癌取得一定成果，并處于研究活躍領域(表2、3)。實際上，早在1953年BACH等就發現精氨酸酶通過破壞精氨酸而抑制Jensen肉瘤細胞的有絲分裂[25]。由于Km值、適宜pH要求和底物特異性等限制，精氨酸脫亞胺酶(ADI)和精氨酸酶現為精氨酸剝奪最常用的酶(圖2)。

(一)ADI 聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG20)抗原性減弱，半衰期增加至7天，可將精氨酸濃度從130 μmol/L降至可檢測水平 (2 μmol/L)以下[23, 26]。

在轉移性肝細胞癌的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，患者每周肌肉注射ADI-PEG20 160 IU/m2。47%(9/19)的患者顯示出臨床應答，其中2人為完全應答。所有患者的中位生存期延長到至少410 d，其中4人存活至680 d[23]。在另一個臨床Ⅱ期試驗中，76位轉移性肝細胞癌患者隨機接受80或160 IU/m2每周的ADI-PEG 20治療共6個月，所有患者的中位生存期大于15.8個月[27]。試驗中，患者耐受良好。另有一個全球的臨床Ⅲ期實驗正在進行中，以進一步確定ADI-PEG在肝癌中的有效性(表2)。

(二)精氨酸酶 經修飾的聚乙二醇重組人精氨酸酶(Peg-rhArg)延長半衰期至6 d，降低對精氨酸的Km值至2.9 mM[28]。

Peg-rhArg的臨床Ⅰ期試驗在晚期肝癌中進行。試驗中單次靜脈注射劑量從 500 U/kg 到 2500 U/kg，在1 600～2 500 U/kg時可實現充分的精氨酸耗竭(血清精氨酸水平<8 uM)。在2 500 U/kg時1位患者出現了劑量限制性毒性。試驗中最好的應答僅是病情穩定(>8周)，占26.7%(4/15)，且有7位患者因疾病進展太快未納入結果評估，如納入，病情穩定率將更低[29]。

圖2 精氨酸剝奪的機制及耐藥機制

圖3 干預肝癌細胞中嘧啶從頭合成

NTC編號分期治療方案對照入選人數地區起始時間(預計)完成時間NCT02101593*[2]ⅠADI-PEG20+索拉菲尼NA[3]8美國2014.112016.2NCT02006030ⅡADI-PEG20+TACETACE40中國臺灣2014.62016.9NCT01287585ⅢADI-PEG20安慰劑636美國、中國、韓國、中國臺灣、英國、意大利2011.72016.6NCT00056992*ⅡADI-PEGNA34美國2002.92003.10NCT02029690ⅠADI-PEG20+順鉑+培美曲塞NA88英國2014.42018.8NCT02102022ⅠADI-PEG20+奧沙利鉑NA148美國2014.112017.10NCT00988195*ⅠPeg-rhArg阿霉素15中國香港2008.52009.5NCT02089633ⅡPeg-rhArg+奧沙利鉑+卡培他濱NA73中國香港2014.42018.3NCT01092091*Ⅰ/ⅡPeg-rhArgNA20中國香港2010.32012.2NCT02089763ⅡPeg-rhArgNA35中國香港2014.42017.4NCT02285101ⅠPeg-rhArgNA36美國2014.112016.6

注：[1]來自https://clinicaltrials.gov/，[2]*表示臨床試驗已完成，[3]未提供

表3 精氨酸剝奪治療肝細胞癌臨床試驗的結果匯總

五、精氨酸剝奪治療肝細胞癌的局限性

精氨酸剝奪在治療肝細胞癌中取得了一定成效，但仍有一定局限性。(一)有效率低(表3)。原因可能如下：(1)ASS1陰性可能存在精氨酸非依賴的其他效應；(2)循環來自ADI的瓜氨酸需要ASS1和ASL，而循環來自精氨酸酶的鳥氨酸除了ASS1和ASL外還需要OTC(圖1)。OTC缺陷的肝癌細胞對ADI天然耐受。故應根據病人基因表達不同而選擇ADI-PEG20和Peg-rhArg[28]。(3)病人選擇、劑量和用藥頻率影響了精氨酸剝奪治療的有效性。(二)耐藥。通過研究耐ADI的黑素瘤變異株，發現其產生了一些變化[32]，這可能與耐藥相關。(1)ASS1再表達。33%(7/21)ASS1陰性的黑素瘤細胞在ADI治療后，重新表達ASS1而對ADI耐受。ADI激活Ras/PI3K/ERK信號通路，c-Myc持續穩定表達，結合到ASS1啟動子上而增加了ASS1表達。(2)耐藥變異體顯示出增強的AKT信號通路和減弱的mTOR信號通路，而對PI3K/AKT抑制劑敏感和對mTOR抑制劑耐受。(3)ADI耐藥細胞葡萄糖轉運體1、乳酸脫氫酶A、谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺酶表達增加，同時丙酮酸脫氫酶表達下降，說明糖酵解增強。(4)耐藥變異體谷氨酰胺脫氫酶和谷氨酰胺酶表達增加，對谷氨酰胺抑制劑敏感。另外，抗ADI抗體出現。治療肝癌的2期臨床試驗中，應用 ADI-PEG20后肝癌細胞中發現了抗ADI抗體，且精氨酸水平出現反彈[30]，抗ADI抗體可能會促進抵抗精氨酸剝奪。(三)精氨酸和NO都有免疫調節作用，精氨酸耗竭方案存在爭議。 Rodríguez等[33]發現Peg-rhArg可間接抑制T細胞應答而促進腫瘤生長。Peg-rhArg誘導髓源性抑制細胞增加而抑制小鼠T細胞增殖，并促進了髓源性抑制細胞數量增多的小鼠中腫瘤的生長。Rodríguez等指出精氨酸剝奪治療有風險。

六、總結與展望

近來，Robinovich等[34]將尿素循環與嘧啶從頭合成相聯系，發現了ASS1缺乏的精氨酸非依賴效應。細胞質中門冬氨酸是ASS1和嘧啶從頭合成中CAD(氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ，門冬氨酸氨基甲酰轉移酶和二氫乳清酸酶的總稱)的共同底物(圖1)。肝癌等細胞缺乏ASS1，細胞質內門冬氨酸水平增高，這使得CAD活性因底物可利用度和mTOR途徑的S6K1磷酸化而增高，促進了嘧啶從頭合成，從而促進了癌細胞增殖。

結合上述發現，干預嘧啶合成可用于治療肝細胞癌。一是抑制citrin，減少嘧啶合成原料，抑制腫瘤增殖。citrin是將線粒體內門冬氨酸運至細胞質的轉運體，對于為嘧啶合成提供底物十分重要。二是降低CAD活性。應用mTOR抑制劑雷帕霉素或胸苷酸合成酶抑制劑5-氟尿嘧啶治療后，細胞增殖受到抑制(圖3)。綜上，精氨酸剝奪在治療肝細胞癌上很有前景，但也有一定局限性。干擾嘧啶從頭合成與精氨酸剝奪治療有共通之處，為攻克肝癌提供了新思路。

[ 1 ] Forner A, Llovet JM, Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet, 2012, 9822: 1245-1255.

[ 2 ] Chen WQ,Zheng QS,Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin, 2016, 2: 115-132.

[ 3 ] Gilroy E. The influence of arginine upon the growth rate of a transplantable tumour in the mouse. Biochem J, 1930, 3: 589-595.

[ 4 ] Gerner EW, Meyskens FL Jr. Polyamines and cancer: old molecules, new understanding. Nat Rev Cancer, 2004. 10: 781-792.

[ 5 ] Wada S, Matsushita Y, Tazawa H, et al. Loss of p53 in stromal fibroblasts enhances tumor cell proliferation through nitric-oxide-mediated cyclooxygenase 2 activation. Free Radic Res, 2015, 3: 269-278.

[ 6 ] Dillon BJ, Prieto VG, Curley SA, et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying comcers sensitive to arginine deprivation. Cancer, 2004, 4: 826-833.

[ 7 ] Feun LG, Marini A, Walker G, et al. Negative argininosuccinate synthetase expression in melanoma tumours may predict clinical benefit from arginine-depleting therapy with pegylated arginine deiminase. Br J Cancer, 2012, 9: 1481-1485.

[ 8 ] Szlosarek PW, Klabatsa A, Pallaska A, et al. In vivo loss of expression of argininosuccinate synthetase in malignant pleural mesothelioma is a biomarker for susceptibility to arginine depletion. Clin Cancer Res, 2006, 23: 7126-7131.

[ 9 ] Szlosarek PW, Fennell DA, Rudd RM, et al. 221 A randomized phase II trial of pegylated arginine deaminase (ADI-PEG 20) in patients with malignant pleural mesothelioma. Lung Cancer, 2006: S54.

[10] Delage B, Luong P, Maharaj L, et al. Promoter methylation of argininosuccinate synthetase-1 sensitises lymphomas to arginine deiminase treatment, autophagy and caspase-dependent apoptosis. Cell Death Dis, 2012,7: e342.

[11] Lan J, Tai HC, Lee SW, et al. Deficiency in expression and epigenetic DNA Methylation of ASS1 gene in nasopharyngeal carcinoma: negative prognostic impact and therapeutic relevance. Tumor Biol, 2014, 1: 161-169.

[12] Kim RH, Coates JM, Bowles TL, et al. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res, 2009, 2: 700-708.

[13] Syed N, Langer J, Janczar K, et al. Epigenetic status of argininosuccinate synthetase and argininosuccinate lyase modulates autophagy and cell death in glioblastoma. Cell Death Dis, 2013,1: e458.

[14] Nicholson LJ, Smith PR, Hiller L, et al. Epigenetic silencing of argininosuccinate synthetase confers resistance to platinum‐induced cell death but collateral sensitivity to arginine auxotrophy in ovarian cancer. Int J Cancer, 2009, 6: 1454-1463.

[15] Allen MD, Luong P, Hudson C, et al. Prognostic and therapeutic impact of argininosuccinate synthetase 1 control in bladder cancer as monitored longitudinally by PET imaging. Cancer Res, 2014, 3: 896-907.

[16] Qiu F, Chen YR, Liu X, et al. Arginine starvation impairs mitochondrial respiratory function in ASS1-deficient breast cancer cells. Sci Signal, 2014, 319: ra31.

[17] Yoon CY, Shim YJ, Kim EH, et al. Renal cell carcinoma does not express argininosuccinate synthetase and is highly sensitive to arginine deprivation via arginine deiminase. Int J Cancer, 2007, 4: 897-905.

[18] Lagarde SM, Ver Loren van Themaat PE, Moerland PD, et al. Analysis of gene expression identifies differentially expressed genes and pathways associated with lymphatic dissemination in patients with adenocarcinoma of the esophagus. Ann Surg Oncol, 2008, 12: 3459-3470.

[19] Tsai WB, Aiba I, Lee S, et al. Resistance to arginine deiminase treatment in melanoma cells is associated with induced argininosuccinate synthetase expression involving c-Myc/HIF-1α/Sp4. Mol Cancer Ther, 2009, 12: 3223-3233.

[20] Kelly MP, Jungbluth AA, Wu BW, et al. Arginine deiminase PEG20 inhibits growth of small cell lung cancers lacking expression of argininosuccinate synthetase. Br j Cancer, 2012, 2: 324-332.

[21] Bowles TL, Kim R, Galante J, et al. Pancreatic cancer cell lines deficient in argininosuccinate synthetase are sensitive to arginine deprivation by arginine deiminase. Int J Cancer, 2008, 8: 1950-1955.

[22] Huang HY, Wu WR, Wang YH, et al. ASS1 as a novel tumor suppressor gene in myxofibrosarcomas: aberrant loss via epigenetic DNA methylation confers aggressive phenotypes, negative prognostic impact, and therapeutic relevance. Clin Cancer Res, 2013, 11: 2861-2872.

[23] Izzo F, Marra P, Beneduce G, et al. Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma: results from phase I/II studies. J Clin Oncol, 2004,10:1815-1822.

[24] Wang S, Tsun ZY, Wolfson RL, et al. Lysosomal amino acid transporter SLC38A9 signals arginine sufficiency to mTORC1. Science, 2015, 6218: 188-194.

[25] Bach SJ, Simon-Reuss I. Arginase, an antimitotic agent in tissue culture. Biochim Biophys Acta, 1953, 953: 396-402.

[26] Holtsberg FW, Ensor CM, Steiner MR, et al. Poly (ethylene glycol)(PEG) conjugated arginine deiminase: effects of PEG formulations on its pharmacological properties. J Control Release, 2002, 1: 259-271.

[27] Lam TL, Wong GK, Chong HC, et al. Recombinant human arginase inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest. Cancer Lett, 2009, 1: 91-100.

[28] Cheng PN, Lam TL, Lam WM, et al. Pegylated recombinant human arginase (rhArg-peg5, 000mw) inhibits the in vitro and in vivo proliferation of human hepatocellular carcinoma through arginine depletion. Cancer Res, 2007, 1: 309-317.

[29] Yau T, Cheng PN, Chan P, et al. A phase 1 dose-escalating study of pegylated recombinant human arginase 1 (Peg-rhArg1) in patients with advanced hepatocellular carcinoma. Invest New Drugs, 2013, 1: 99-107.

[30] Glazer ES, Piccirillo M, Albino V, et al. Phase II study of pegylated arginine deiminase for nonresectable and metastatic hepatocellular carcinoma. J Clin Oncol, 2010, 13: 2220-2226.

[31] Yang TS, Lu SN, Chao Y, et al. A randomised phase II study of pegylated arginine deiminase (ADI-PEG 20) in Asian advanced hepatocellular carcinoma patients. Br j Cancer, 2010, 7: 954-960.

[32] Long Y, Tsai WB, Wangpaichitr M, et al. Arginine deiminase resistance in melanoma cells is associated with metabolic reprogramming, glucose dependence, and glutamine addiction. Mol Cancer Ther, 2013, 11: 2581-2590.

[33] Rodríguez PC, Ochoa AC. Arginine regulation by myeloid derived suppressor cells and tolerance in cancer: mechanisms and therapeutic perspectives. Immunol Rev, 2008, 1: 180-191.

[34] Rabinovich S, Adler L, Yizhak K, et al. Diversion of aspartate in ASS1-deficient tumours fosters de novo pyrimidine synthesis. Nature, 2015, 7578: 379-383.

(本文編輯：張苗)

國家自然科學基金(81302593)；河南省高等學校重點科研項目(15A320083)

450000 河南 鄭州大學第一附屬醫院感染病科(陳潔，曾慶磊，胡秋月，余炎，余祖江)，重點實驗室(李晶晶)

余祖江，Email: johnyuem@zzu.edu.cn

2016-09-03)