高效液相色譜法測定水產品中15種多環芳烴

湯水粉，錢卓真，羅方方，王麗娟

(福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

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高效液相色譜法測定水產品中15種多環芳烴

湯水粉，錢卓真，羅方方，王麗娟

(福建省水產研究所，福建 廈門 361013)

本文采用QuEChERS 技術，對前處理條件進行改進，然后通過對色譜條件的優化，實現水產品中15種PAHs的高效液相色譜法檢測。在優化條件下，15種PAHs線性范圍為1～50 ng/mL，線性相關系數大于0.995；以信噪比(S/N)≥3 確定各組分的檢出限，15種PAHs的檢出限在0.1～2.0 μg/kg之間。對對蝦樣品進行15種PAHs污染物的加標實驗，回收率在75.8%～101%范圍內，相對標準偏差小于15.0%。最后，將QuEChERS-高效液相色譜法應用于實際樣品中15種PAHs的檢測，結果證明，該方法操作簡便、靈敏度高，適用于水產品中PAHs污染物的檢測。

多環芳烴(PAHs)；水產品； 高效液相色譜； QuEChERS

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由二至七個不等的苯環組成的芳香族化合物，為人們熟知的持久性有機污染物之一，也是世界上最早發現的對人類有致癌效應的一類污染物，具有潛在致癌、致畸、致突變效應等特點[1-2]。PAHs主要通過廢水排放、大氣沉降、地表徑流及原油泄露等多種途徑進入水體，對水生生物造成不利影響，并通過飲水、皮膚接觸及水產品食用等途徑危害人體健康。近年來，國內外均有報道PAHs在不同食品中的檢出，其中蔬菜、水果、油品、谷類及煙熏肉制品等食品中均有PAHs檢出[3-6]。世界各國對PAHs都有嚴格限制，美國EPA 將16 種多環芳烴列入優先控制污染物名單，歐盟以及WHO 也采取了限制PAHs 的措施[7]，中國GB 2762—2005《食品中污染物限量》標準規定熏烤肉、糧食中苯并(a)芘限值5 μg/kg、植物油中為10 μg/kg[8]。因此，研究水體及水產品PAHs的污染特征及其健康風險具有重要意義。

目前，PAHs的檢測方法主要有氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[9-10]和高效液相色譜法[11-12]。分光光度法僅適用于某種特定PAHs的測定，且基質干擾較大，靈敏度達不到檢測要求。GC-MS法引入特征碎片離子，對多組分具有較好的確證能力，但是提取過程繁瑣，且三種苯并熒蒽難以用氣相色譜法分離，重質PAHs的回收率較低[2]。高效液相色譜法操作簡單，靈敏度高，且具有較好的選擇性和準確性[13]，是目前水產品藥物殘留檢測的主要方法。因此，研究采用QuEChERS技術，對前處理條件進行改進，然后通過對色譜條件的優化，旨在實現水產品中15種PAHs的高效液相色譜法檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

魚取背部肌肉；蝦、蟹類等取可食部分。用絞肉機絞成漿狀，裝入潔凈塑封袋，-18℃貯存。

1.2 儀器與試劑

Waters 2695液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測器、Empower工作站軟件：Waters公司；漩渦振蕩器：德國IKA；旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；低速離心機、高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

PAHs標準品：德國Dr.Ehrenstorfer，純度≥98%；Florisil/C18固相萃取小柱：北京振翔科技有限公司；無水硫酸鈉，無水硫酸鎂：國藥集團化學試劑有限公司，分析純；乙腈：美國Tedia，色譜純；實驗用水為Millipore Academic 制備的超純水。

1.3 樣品前處理方法

稱取(5.00±0.05)g已均質的組織樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL超純水，混合振搖1 min，然后加入15 mL乙腈劇烈振搖1 min，接著加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水乙酸鈉，渦漩1 min，6 000 r/min離心5 min，使有機相和水相分層，有機相即樣液。

Florisil/C18小柱用5 mL乙腈預淋洗，再準確移取5 mL樣液上樣，用5 mL乙腈洗脫三次，收集全部流出液于100 mL雞心瓶中，旋蒸至近干，乙腈定容至1 mL，過0.2 μm濾膜后，供高效液相色譜分析。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Thermo HYPERSIL Green PAH，5 μm，4.6 mm× 150 mm；

流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；流動相為水(A)、乙腈(B)的混合溶液。梯度條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.5 標準曲線繪制

吸取適量的PAHs標準溶液，用乙腈-水配制成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標準溶液，各吸取50 μL系列標準溶液進樣分析，據各組分的響應峰面積與相應的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.6 回收率與精密度

稱取(5.00±0.05)g勻漿后的樣品，加入一定量不同濃度的PAHs標準溶液，然后按同樣的樣品前處理方法進行提取、凈化以及高效液相色譜檢測，計算各種多環芳烴的回收率及相對標準偏差。

2 實驗結果與討論

2.1 梯度洗脫條件的選擇

結合參考PAHs色譜分析方法的文獻報道[14-15]，PAHs流動相主要是乙腈-水混合溶液，由于流動相的比例直接影響樣品保留時間和峰面積，實驗通過不同的有機相配比，即有機相濃度分別為40%、45%、51%、60%，對樣品組分保留時間與目標峰的分離進行優化。實驗結果發現，有機相太小，保留時間靠前的PAHs如萘、苊、芴菲、蒽不能較好的分離；有機相比例越大，保留時間靠前的13種PAHs組分分離較好，而高分子量的PAHs保留時間長且峰形差。因此，本實驗經過優化，選擇梯度程序進行洗脫，確保15種多環芳烴物質的有效分離。

2.2 檢測波長的選擇

相對紫外檢測法，熒光檢測法受雜質的干擾較小，靈敏度較高，因此采用熒光法測定15種PAHs污染物。參考相關的文獻報道[16-17]，同時根據15 種PAHs 的保留時間和最佳激發波長、發射波長，確定各個物質的測定波長(表2)。在優化的檢測條件下，各種PAHs污染物能夠很好的分離，且基線平穩、峰形好(圖1)。

表2 PAHs的熒光檢測波長程序

2.3 提取凈化方法的選擇

目前，針對食品樣品基質中PAHs的前處理技術主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取法等。

由于PAHs屬于親脂性物質，容易在樣品的脂質組分中擴散，并存在于組織細胞內部[18]，因此必須選擇合適的提取方法才能有效分離萃取PAHs。實驗分別考察了正己烷-二氯甲烷、甲醇-氫氧化鉀-環己烷以及QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe) 技術等幾種前處理方法對PAHs提取效率的影響。實驗結果發現，當用正己烷-二氯甲烷提取時，回收率不能滿足要求；用甲醇-氫氧化鉀-環己烷提取步驟繁瑣；QuEChERS 技術通過乙腈沉降蛋白，無水乙酸鈉和無水硫酸鎂進行鹽析脫水，再用Florisil /C18固相萃取柱去除脂肪，實驗發現，當采用QuEChERS 技術對水產品中15種PAHs進行提取時，基質干擾小、回收率高，能滿足水產品中農藥殘留檢測要求。因此，實驗采用QuEChERS 技術對水產品中15種多環芳烴進行提取。

然而在用Florisil /C18固相萃取柱除脂過程中發現，當用乙腈進行一次洗脫時，回收率很低，進而進行二次洗脫。實驗結果表明，第二次洗脫液中仍有部分待測物，兩次洗脫后回收率仍達不到要求。因此，本實驗采用三次洗脫并收集全部流出液的方法進行除脂凈化。

2.4 濃縮過程的優化

PAHs是揮發性碳氫化合物，所以在濃縮過程中可能會有揮發損失。實驗也發現，在旋蒸濃縮時，如果完全蒸干，對低碳的物質尤其是PAHs中萘的回收率有很大影響，這可能就是因為PAHs沸點較低，過分蒸干導致目標物揮發。因此，為了防止易揮發組分在濃縮過程中揮發損失，在實驗中，待測組分旋轉蒸發濃縮至近干，然后用乙腈定容至1 mL。再過0.22 μm有機濾膜，待測。

2.5 線性相關和檢出限

吸取適量PAHs標準溶液，用乙腈-水配制成濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的系列標準溶液，各吸取50 μL進樣分析，據各組分的響應峰面積與相應的質量濃度進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表 2。以信噪比(S/N)≥3 確定各組分的檢出限，萘的檢出限為2.0 μg/kg，芴、芘、苯并(a)蒽、苯并(k)熒蒽為0.1 μg/kg，苯并(a)芘為0.5 μg/kg，其它PAHs為1.0 μg/kg。可見15 種PAHs 的線性良好，靈敏度較高，說明高效液相色譜法可用于水產品中15種PAHs含量的測定。

表3 15種多環芳烴的線性方程及相關系數

2.6 方法準確性

以蝦、蟹、魚等樣品為研究對象，在相同的樣品處理條件下對15種PAHs污染物進行加標回收和精密度實驗。圖2為對蝦樣品和加標樣品的色譜圖，以考察方法的準確度和重現性；實驗結果見表4。從表4可知，在不同濃度的加標濃度下，樣品的回收率均在75.8%～101%之間，相對標準偏均差在15.0%以下。從試驗結果可以看出，高效液相色譜法的準確度和精密度滿足水產品中PAHs污染物殘留檢測的要求。

表4 對蝦加標樣的回收率和相對標準偏差

組分名稱Nameoftheanalytes加標量/(μg/kg)Spikedconcentrations平均回收率/%Averagerecoveries相對標準偏差/%RSD萘Naphthalene(Nap)10.095.68.49苊Acenaphthene(Ace)10.092.413.7

續表4

3 實際樣品應用

實驗應用QuEChERS技術結合高效液相色譜法，對2014年采集的60個蝦、蟹樣品進行分析，實驗結果表明，該方法準確度高、實用性強，適用于水產品中PAHs的檢測，該方法為進一步排查水產中PAHs的隱患和風險評估提供技術支持。

4 結論

實驗通過對前處理條件及檢測條件的優化，實現水產品中15種PAHs污染物殘留的同時測定。在提取過程中，采用QuEChERS技術提取樣品中的PAHs；而在色譜檢測時，采用熒光法，通過多梯度程序和檢測波長的優化，實現水產品中15種PAHs的有效分離。

在本實驗檢測條件下，15種PAHs線性范圍為1～50 ng/mL，線性相關系數均大于0.995。以信噪比(S/N)≥3確定各組分的檢出限，萘的檢出限為2.0 μg/kg，芴、芘、苯并(a)蒽、苯并(k)熒蒽為0.1 μg/kg，苯并(a)芘為0.5 μg/kg，其它PAHs為1.0 μg/kg。對對蝦樣品進行加標實驗，當加標量為10 μg/kg時，回收率在75.8%～101%之間，相對標準偏差均在15.0%以下。QuEChERS-高效液相色譜法與其他常用提取方法相比，能有效提高水產品中PAHs的回收率，而且設備簡單、操作簡便、靈敏度高，適用于水產品中PAHs污染物的檢測。

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Determination of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)residues in aquatic products by high performance liquid chromatography

TANG Shuifen，QIAN Zhuozhen，LUO Fangfang，WANG Lijuan

(Fisheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

The testing conditions were optimizing and improving based on QuEChERS technique combined with high performance liquid chromatography(HPLC)，which is frequently used for pesticide detection in aquatic products.In the optimized conditions，15 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)residues in aquatic products were separated and detected by HPLC.The calibration curves were linear in a concentrations range of 1～50 ng/mL for 15 PAHs with correlation coefficients over 0.995.As(S/N)≥3，the limits of detection was 0.1～2.0 μg/kg.The average recovery ranged from 75.8% to 101% and the relative standard deviation was below 15.0% for spiked shrimp sample with PAHs.Finally，QuEChERS-HPLC was applied for PAHs detecting in practical samples and presented that this method was simple and sensitive to be suitable for PAHs determination in aquatic products．

polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)；aquatic products；high performance liquid chromatography；QuEChERS

2016-08-11 資助項目：福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1003-13)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發技術公共服務平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經濟生物種質庫與資源高效開發技術公共服務平臺(14PZY017NF17).

湯水粉(1985-)女，工程師，主要從事水產品質量安全檢測.E-mail：powder2005@126.com

O656.31

A

1006-5601(2016)05-0394-08

湯水粉，錢卓真，羅方方，等.高效液相色譜法測定水產品中15種多環芳烴[J].漁業研究，2016，38(5)：394-401.