甘肅武威薄皮核桃莖尖組織培養(yǎng)中防褐變措施的研究

張春梅，閆 芳，陳杰昌，白 鵬

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院，甘肅張掖 734000；3.金昌市永昌縣花草灘林場，甘肅永昌 737200）

甘肅武威薄皮核桃莖尖組織培養(yǎng)中防褐變措施的研究

張春梅1，閆 芳2，陳杰昌3，白 鵬1

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院生態(tài)與綠洲農(nóng)業(yè)研究院，甘肅張掖 734000；3.金昌市永昌縣花草灘林場，甘肅永昌 737200）

以多年生武威薄皮核桃莖尖為試材，研究了培養(yǎng)基成分、不同種類和質(zhì)量濃度的褐變抑制劑、生長調(diào)節(jié)劑以及轉(zhuǎn)瓶周期對其褐變的影響。結(jié)果表明：培養(yǎng)基成分、褐變抑制劑、生長調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)瓶周期對外植體褐變的影響均不同；為抑制褐變及保證莖尖正常分化生長，先將莖尖接種于1/2 MS+2 g/L活性炭的培養(yǎng)基中，置于5℃冰箱中暗培養(yǎng)7 d后取出，再轉(zhuǎn)接于DKW+ 6-BA（1.0 mg/L）+IAA（0.01 mg/L）+5 mL 20％硫代硫酸鈉的培養(yǎng)基中，置于25℃室內(nèi)光照環(huán)境下培養(yǎng)，每隔3～5 d轉(zhuǎn)換1次培養(yǎng)基，能有效抑制褐變。

核桃；組織培養(yǎng)；褐變；抗氧化劑

0 引言

核桃（Juglans regia）系胡桃科，屬于多年生植物，是世界著名四大干果之一。目前，世界核桃年產(chǎn)量92萬噸。我國作為核桃原產(chǎn)地之一，栽培歷史悠久。核桃在我國分布廣泛，年產(chǎn)30萬噸，占世界1/3，種質(zhì)資源極為豐富。云南年產(chǎn)6.1萬噸，占全國產(chǎn)量1/5，產(chǎn)值達(dá)6億元，已經(jīng)成為我國核桃的主產(chǎn)大省。［1］

核桃以其很高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會效益而被廣泛種植，［2-5］其潛在的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健功能日益受到國內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注，深受消費(fèi)者喜愛。

隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的興起，為核桃的快速繁殖和組培、細(xì)胞水平的遺傳改良提供了一條有效的途徑。［6-7］褐化現(xiàn)象是果樹組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象，桃［8］、杏［9］、櫻桃［10］、李［11］等都有關(guān)于褐變的報(bào)道，核桃表現(xiàn)的更為明顯。其外植體一般在接種后就出現(xiàn)褐變，最后導(dǎo)致外植體褐變死亡，因此，難以建立無性繁殖體系。［12］因而，在核桃離體培養(yǎng)中，防止外植體褐變死亡是其能否培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或酚類吸附劑是防止外植體褐變的常用的方法。［13］本實(shí)驗(yàn)以多年生武威薄皮核桃莖尖為試材，研究在培養(yǎng)基中加入不同褐變抑制劑對核桃莖尖褐變的影響，以期為核桃的快速繁殖和組培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取了多年生武威薄皮核桃的優(yōu)質(zhì)莖尖，1 cm長的切段。實(shí)驗(yàn)于2013年5月至2014年7月在河西學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)樓植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。

1.2 莖尖的滅菌

將除去葉片鱗片的莖尖用自來水沖洗0.5 h，然后用70％的酒精溶液浸泡0.5～1 min（幼樹莖尖可以不用酒精浸泡），再用0.1％的升汞溶液［14］浸泡7～10 min（幼樹莖尖滅菌時間相對短一些，為7～8 min，成年老樹莖尖滅菌時間相對長一些，為9～10 min）。取出后用無菌水漂洗5次，接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上誘導(dǎo)其生長。

1.3 培養(yǎng)基及應(yīng)用方法

實(shí)驗(yàn)采用兩種基本培養(yǎng)基（1/2 MS+2 g/L活性炭、DKW）與添加6-BA 1.0 mg/L和IAA 0.01 mg/L的組合培養(yǎng)基進(jìn)行對比。采用兩步法：第一步將莖尖接種于培養(yǎng)基上，在5℃冰箱中黑暗放置7 d；第二步放于25℃室內(nèi)自然光照環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值為6.2，瓊脂6.0 g/L，糖30 g/L。后期培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為DKW。在DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培養(yǎng)基中添加不同含量的褐變抑制劑（維生素C、20％Na2S2O3、活性炭）［15］，比較其對生長及褐變的影響。

在DKW培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑（6-BA、2，4-D、NAA、IAA）［16］比較其對生長及褐變的影響。

2 結(jié)果分析

2.1 不同培養(yǎng)基對核桃莖尖生長及褐變的影響

取生長健壯的莖尖做實(shí)驗(yàn)材料，在各種培養(yǎng)基上各接種10個外植體，重復(fù)2次，其他條件均一致，觀察不同培養(yǎng)基上外植體的情況，結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)基對核桃莖尖生長及褐變的影響Table 1 The effects of different medium on growth and browning of the walnut shoot tips

由表1可知，在1/2 MS+2 g/L活性炭培養(yǎng)基中，莖尖褐變率較低，但生長不明顯或無生長；在DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L組合培養(yǎng)基中，褐變率偏高，但外植體有生長；在1/2MS+2 g/L活性炭+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L組合培養(yǎng)基中，生長弱或無生長現(xiàn)象，褐變率可維持在一定范圍內(nèi)。

改變培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將接種好的外植體置于5℃冰箱中7 d后取出，再置于25℃室內(nèi)自然光照條件下培養(yǎng)，褐變率有所降低。實(shí)驗(yàn)表明，將外植體接種于1/2 MS+2 g/L活性炭的培養(yǎng)基中，置于5℃冰箱黑暗培養(yǎng)7d后取出轉(zhuǎn)接于DKW+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培養(yǎng)基中，置于25℃室內(nèi)自然光照培養(yǎng)，降低褐變率效果較好，但隨時間延長，褐變現(xiàn)象也隨之出現(xiàn)并趨于嚴(yán)重，因此還需要采取措施進(jìn)一步抑制褐變。

2.2 添加不同質(zhì)量濃度的褐變抑制劑對核桃莖尖生長及褐變的影響

在DKW+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.01 mg/L組合培養(yǎng)基中添加不同褐變抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可知，不同種類和不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑、抑制劑、吸附劑對核桃莖尖的生長分化和褐變有不同影響。在各種配比的培養(yǎng)基中，以添加5 mL 20％Na2S2O3的培養(yǎng)基效果最好，褐變得到一定控制，莖尖生長與其他組織相比有明顯改善。

表2 在培養(yǎng)基中添加不同添加劑濃度的褐變抑制劑對褐變的影響Table 2 The effects of the medium add the different additives browning inhibitors on browning

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑對核桃莖尖生長及褐變的影響

在DKW培養(yǎng)基中添加不同種類和不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑，觀察其對莖尖的生長分化和褐變的影響，結(jié)果見表3。

表3 在DKW培養(yǎng)基中添加不同的生長調(diào)節(jié)劑對褐變的影響Table 3 The effects of the DKW medium add the different growth regulator

由表3可知，采用DKW+6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.01 mg/L+5 mL 20％Na2S2O3的培養(yǎng)基，在25℃室內(nèi)自然光照下培養(yǎng)，可有效控制褐變的產(chǎn)生。隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，褐變率也隨之增高，褐變反應(yīng)時間提早，先是出現(xiàn)絮狀物，之后逐漸擴(kuò)散，最終死亡。質(zhì)量添加2，4-D、IAA的組合中，褐變反應(yīng)時間稍推遲，培養(yǎng)基上有絮狀物產(chǎn)生。

2.4 外植體轉(zhuǎn)瓶周期對核桃莖尖生長及褐變的影響

在實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行3個周期（5 d、10 d、20 d）的轉(zhuǎn)瓶，觀察現(xiàn)象，結(jié)果見表4。

由表4可知，5 d轉(zhuǎn)瓶1次，既不影響莖尖生長，又可有效抑制褐變。對于易褐變的材料，若接種后轉(zhuǎn)瓶周期時間長，傷口周圍積累的酚類物質(zhì)增多，會加重褐變。

表4 不同轉(zhuǎn)瓶周期對核桃莖尖生長及褐變的影響Table 4 The effects of different rotating period on growth and browning of the walnut shoot tips

3 結(jié)果與討論

目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變多數(shù)是由酶促褐變引起的，［17］培養(yǎng)材料褐變是由傷口分泌的酚類化合物被氧化的結(jié)果。［18］酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素的合成前體。因此，當(dāng)酚類化合物含量高時，木質(zhì)素、單寧或色素的形成就多，易導(dǎo)致褐變的發(fā)生。［19］培養(yǎng)材料的種類與品種、外植體的生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、生長部位等內(nèi)因，以及培養(yǎng)基成分、添加激素的種類和濃度、培養(yǎng)條件等外因，都會影響褐變的發(fā)生。前人已經(jīng)對影響蝴蝶蘭［20］、中華紅葉楊［21］、銀杏愈傷組織［22］等外植體褐變的因素進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)是針對核桃組培中產(chǎn)生褐變的外因進(jìn)行研究，通過改變培養(yǎng)基的種類及其成分，控制初代培養(yǎng)中的褐變。

3.1 不同培養(yǎng)基對核桃莖尖生長及褐變的影響

本實(shí)驗(yàn)采用1/2 MS+2 g/L活性炭。先將其置于5℃冰箱內(nèi)暗培養(yǎng)1周后取出，再轉(zhuǎn)接于DKW +6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.01 mg/L培養(yǎng)基中，置于25℃室內(nèi)自然光照下培養(yǎng)，減少酚類物質(zhì)外溢，減輕褐變，并可在一定時間內(nèi)維持外植體生長不受褐變影響，這與前人的研究結(jié)果一致。［20-21］但隨著時間延長，又出現(xiàn)褐變現(xiàn)象并趨于嚴(yán)重，需添加其他抑制劑來抑制褐變的發(fā)生。

3.2 添加不同質(zhì)量濃度的褐變抑制劑對核桃莖尖生長及褐變的影響

張智等人在抗氧化劑對銀杏愈傷組織褐變影響的實(shí)驗(yàn)中表明，不同質(zhì)量濃度的維生素C（Vc）、檸檬酸、鏷（PA）3種抗氧化劑對抑制褐變的效果為：Vc＞檸檬酸＞PA；［22］張紅在庫拉索蘆薈組培中的褐變現(xiàn)象及防止實(shí)驗(yàn)中表明：用庫拉索蘆薈莖尖做外植體，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L做培養(yǎng)基，并加入活性炭500.0 mg/L，環(huán)境溫度控制在25℃有利于減輕褐變。［23］本實(shí)驗(yàn)中，通過添加不同褐變抑制劑表明：培養(yǎng)基中添加5 mL 20％ Na2S2O3能有效抑制褐變且不影響植株生長，這與前人的研究結(jié)果一致。［24］

3.3 不同生長調(diào)節(jié)劑對核桃莖尖生長及褐變的影響

不同種類和質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對核桃莖尖生長及褐變有一定影響，高質(zhì)量濃度6-BA刺激酚類污染，而生長素2，4-D及IAA能延緩多酚合成從而減輕褐變。實(shí)驗(yàn)證明：在DKW培養(yǎng)基中加入6-BA 1.0 mg/L和IAA 0.01 mg/L較適宜核桃莖尖生長并能夠減輕褐變，這與前人的研究結(jié)果稍有不同，究其原因應(yīng)該是所研究的品種不同。［25］

3.4 外植體轉(zhuǎn)瓶周期對核桃莖尖生長及褐變的影響

接種后，外植體培養(yǎng)時間過長，未及時轉(zhuǎn)移，傷口周圍積累酚類物質(zhì)增多，褐變加重，甚至導(dǎo)致外植體死亡，這種現(xiàn)象在組培中經(jīng)常可見。適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)瓶周期，可減少傷口周圍酚類物質(zhì)的積累，從而減輕褐變。

3.5 溫度、光照對核桃莖尖生長及褐變均有影響

本實(shí)驗(yàn)前期采用低溫（5℃）黑暗處理旨在利用低溫抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，減少酚類氧化，從而減輕褐變。但低溫時間過長，植株存活率隨之下降，這與前人的研究結(jié)果一致。［26-27］實(shí)驗(yàn)表明，低溫宜控制在7 d左右，暗處理之所以能控制外植體褐變，是因?yàn)樵诜宇惢衔锏暮铣珊脱趸^程中，有許多酶系統(tǒng)參與，其中部分酶系統(tǒng)的活性是受光誘導(dǎo)的。因此，前期需無光培養(yǎng)，后期轉(zhuǎn)至25℃室內(nèi)自然光條件下培養(yǎng)。

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（責(zé)任編輯 柴 智）

The Study of the Anti-Browning in Tissue Culture of the Walnuts

ZHANG Chun-mei1，YAN Fang2，CHEN Jie-Chang3，BAI Peng1
（1.College of Agriculture and Biology Technology，Hexi University，Zhangye Gansu 734000，China；2.Ecological&Oasis Agricultural Research Institute of Hexi University，Zhangye Gansu 734000，China；3.Flower-grass Beach Forest Farm，Yongchang，Jinchang City，Gansu 737200，China）

Taking the perennial walnut shoot tips as materials，we have studied the effects of medium ingredients，browning inhibitors of different kinds and concentrations，growth regulators and the rotating period on the browning of explants.The results showed that the effects of ingredients，browning inhibitors and rotating period on the browning of walnuts explants are different.Moreover，we first stem tip into 1/2 MS+2 g/L of active carbon medium，which can be placed on the refrigerator during 7 days under 5℃darkness in order to browning inhibition system and guarantee the growth and normal differentiation of stem tip.Thus，it was inoculated into DKW+6-BA（1.0 mg/L）+IAA（0.01 mg/L）+5 mL 20％Na2S2O3medium，converted one medium per every 3-5 days，which can effectively inhibit browning of walnut.

Walnut；Tissue culture；Browning；Antioxidants

S 664.1

A

1005-0310（2016）03-0043-05

10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.03.008

2013-05-11

甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（項(xiàng)目號XZ1003）。

張春梅（1978-），女，甘肅酒泉人，河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院副教授，博士，主要從事植物生理、植物組織培養(yǎng)研究。E-mail：zazcm197828@163.com