產葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩定性研究

辛國芹，董佩佩，汪祥燕，趙影，劉秀俠，徐海燕*，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

產葡萄糖氧化酶菌株的誘變篩選及遺傳穩定性研究

辛國芹，董佩佩，汪祥燕，趙影，劉秀俠，徐海燕*，谷巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

采用平板顯色初篩、Underbofler滴定法復篩及紫外-硫酸二乙酯復合誘變的方法，從臨沂果園土樣中得到一株產葡萄糖氧化酶（GOD）活性較好的菌株，命名為Bla-6，其產GOD酶活為（10.50±0.25）U/mL，與原始菌株LPA-4產GOD酶活（6.75 U/mL）相比提高了55.57%。結合5.8S rDNA-ITS區序列系統進化、菌落形態、生長特性、菌體形態等確定其分類地位。結果表明，所得菌株Bla-6被鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger），經8代傳代培養后，GOD酶活維持在10.5 U/mL左右，該菌株遺傳穩定性較好。

葡萄糖氧化酶；黑曲霉；誘變；遺傳穩定性

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種需氧脫氫酶，最早在黑曲霉（Aspergillus niger）提取物中發現[1]。GOD廣泛地分布于動物、植物和微生物體內，在有過氧化氫酶存在時，可專一性氧化葡糖糖成葡萄糖酸和過氧化氫。作為一種新型的綠色天然酶制劑，GOD在食品、工業、醫藥、養殖業、紡織漂染[2]和生物等領域應用十分廣泛[3-7]。GOD安全、無毒副作用，2013年農業部將飼料級GOD生產菌株限定為青霉菌（Penicillium）和黑曲霉菌（Aspergillusniger）。國外對微生物發酵生產GOD酶制劑的發酵工藝研究將近30年，HATZINIKOLAOU D G等[8]研究發現黑曲霉發酵生產GOD酶活多在2～7 U/mL，活性普遍較低，無法滿足生產需要。2002年，MIRON J等[9]研究發現通過黑曲霉發酵菌株浸沒培養法可優化生產GOD。目前，受技術水平、儀器設備等因素的限制，我國工業生產GOD酶制劑存在成本高、穩定性及酶活性較差等問題。GOD應用廣泛，是一種很有潛力的生物催化劑，因此如何獲得高活性、高穩定性、高產量的GOD，解決高成本、難純化等問題是當前研究的重點[10]，隨著研究的不斷深入，GOD的應用前景會更加廣闊。如何更加經濟有效地制備高純度、高酶活、高穩定性的GOD是急需解決的問題。

紫外誘變和化學誘變法篩選獲得GOD生產菌株是提高原始菌株產酶能力的有效方法。RAY S等[11]通過聚乙烯亞胺和紫外誘變處理黑曲霉孢子共得到1 976株突變株，其中黑曲霉AB1801產葡萄糖酸鈣達120 g/L。朱洪菊[12]以初始GOD酶活為1.21 U/mL的黑曲霉菌株為出發菌株，通過紫外誘變、微波誘變處理，最終篩選出了一株酶活達到5.32 U/mL的突變株C3。朱運平等[13]以黑曲霉為出發菌株，通過紫外誘變、亞硝酸鈉化學誘變及紫外-亞硝酸鈉復合誘變三種方法篩選得到一株高產胞外GOD的突變株，產GOD酶活力達186.32 U/mL，為原始菌株的3.8倍，且產酶能力穩定。此外，定向突變獲得高產GOD突變菌株的研究處于起步階段，發展潛力很大。HOLLAND J T等[14]將黑曲霉GOD基因132位的蘇氨酸定向突變成絲氨酸時，發現特異性常數kcat/Km升高較為顯著，同時對底物親和力僅降低3%。本研究從果園土壤中篩選產GOD的菌株，并采用紫外-硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）復合誘變篩選高產GOD的菌株，旨在為其應用于工業化發酵生產提供一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從山東省臨沂市秋季桃園內多點混合采集深度為0～10 cm的土樣。本試驗所選用的平板分離培養基、斜面培養基及發酵培養基詳見參考文獻[15]。硫代硫酸鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；硫酸二乙酯（DES）（色譜純）：上海譜振生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F型超凈工作臺：江蘇通凈凈化設備有限公司；HPX-9082MBE型數顯電熱培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHZ-CA型大容量振蕩器：太倉市實驗設備廠；FA-1004型電子分析天平：上海太平儀器廠；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 產GOD菌株的初篩

稱取10 g采集的土樣于帶有玻璃珠的100 mL生理鹽水中，振蕩培養30 min，吸取1 mL土樣上清液梯度稀釋，涂布于平板分離培養基，28℃培養3 d后觀察平板，將出現藍色圈的菌株接種到斜面培養基上30℃培養2 d至產生黑色孢子，而后進行復篩。

1.3.2 產GOD菌株的復篩及GOD酶活測定

將斜面培養基上菌株接種于發酵培養基中，于30℃、180 r/min恒溫搖床培養5 d，采用Underbofler滴定法[16]測定菌株產GOD酶活。

GOD酶活：測定發酵液經5 000 r/min離心10 min得粗酶液。取250mL三角瓶，加入2%葡萄糖磷酸緩沖溶液25mL及1 mL粗酶液，立即置于30℃水浴振蕩1 h然后加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液終止反應，用0.1 mol/L HCl滴定剩余的NaOH，記錄所消耗的HCl體積為A，空白組（CK）用1 mL蒸餾水替代粗酶液，其他操作相同，記錄所消耗的HCl體積B，每個樣品測定3個平行，取均值計算酶活。

GOD酶活=（B-A）×F×N×1 000/60

式中：A為中和NaOH所消耗的HCl體積，mL；B為空白組中和NaOH所消耗的HCl體積，mL；F為粗酶液稀釋倍數，N為HCl濃度，mol/L；1 000為單位換算系數；60為反應時間，min。

GOD酶活的定義：在上述實驗條件下每分鐘催化氧化1μmol/L的葡萄糖的酶量定義為一個酶活單位，以1μmol/min表示，即1 U/mL。

1.3.3 產GOD菌株的紫外-硫酸二乙酯復合誘變

將復篩菌株在斜面培養基上培養長滿孢子后，用適量的無菌生理鹽水洗脫斜面培養基上的孢子，置于三角瓶中，180 r/min振蕩20 min后用脫脂棉過濾菌絲從而得到分散的單孢子懸液，血球計數法計算孢子數。

將孢子懸液均勻地鋪于已滅菌7cm表面皿中，制成1mm左右的薄層，于超凈工作臺的紫外燈下照射15 s后，進行梯度稀釋，稀釋度為10-1～10-6。取10-4～10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2mL，涂布于斜面培養基平板上，30℃避光培養2～3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養基上，30℃培養至孢子產生，再通過發酵培養基測定菌株產GOD酶活。選取產酶活高的菌株進行保存。

以紫外線誘變所得產GOD酶活最高的菌株為出發菌株，進行硫酸二乙酯誘變。取5 mL經紫外線誘變的高產GOD酶活孢子懸液加入體積為25 mL的三角瓶中，再加入0.2 mL體積分數為50%的DES，振蕩40 min，再加入0.5 mL的硫代硫酸鈉（85%）終止反應。稀釋梯度為10-1～10-6。取10-4～10-63個稀釋度的孢子懸液各0.2 mL，涂布于斜面培養基平板上，30℃倒置培養2～3 d。挑取平板上生長速度較快的單菌落接種到斜面培養基上，30℃培養至孢子產生，再通過發酵培養基測定菌株產GOD酶活。選取產酶活高的菌株進行保存。

1.3.4 產GOD菌株的鑒定

采用5.8S rDNA-ITS區序列法對篩選到的產GOD酶性能較好的菌株進行鑒定，構建系統發育樹。待測菌株培養3d后挑取菌至發酵培養基中，30℃、160 r/min振蕩培養2 d，然后將菌絲過濾烘干，采用生工生物工程（上海）股份有限公司真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取待測菌的基因組總DNA。

采用引物ITS1與ITS4對5.8S rDNA-ITS區序列進行擴增，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增反應體系及反應條件詳見參考文獻[15]。將PCR擴增產物送北京博尚公司測序，在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI）中進行基本的局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，用DNAMAN 6.0軟件進行多重序列比較，用MEGA 3.1構建系統發育樹。

1.3.5 遺傳穩定性測定

將經過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選得到的產GOD酶活最高的菌株連續8代傳代培養后，觀察菌株的生長性能、菌落形態，測定各代菌株產GOD酶活。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品中產GOD菌株的篩選

對果園土壤樣品初步篩選分離得到16株產GOD的菌株，挑取初篩平板中藍色反應圈較大的6株菌至斜面培養基30℃培養產生黑色孢子后轉接至發酵培養基進行復篩，30℃、180 r/min振蕩培養5 d后，采用Underbofler滴定法測定菌株產GOD酶活力，結果如表1所示。

表1 分離菌株產GOD酶活測定結果Table 1 Determination results of GOD activity produced by isolated strains

由表1可知，以菌株LPA-4產GOD酶活力最高，發酵5 d后發酵液中GOD酶活可達6.750U/mL，因此選定菌株LPA-4進行后續誘變試驗。

2.2 誘變篩選結果

2.2.1 紫外誘變篩選結果

對土壤樣品中篩選得到菌株LPA-4進行紫外誘變，篩選得到8株菌進行發酵培養，其GOD酶活測定結果如表2所示。

表2 紫外誘變菌株產GOD酶活測定結果Table 2 Determination results of GOD activity produced by UV-light mutagenesis strains

由表2可知，大部分菌株紫外誘變后與原始株LPA-4相比，產GOD性能無明顯提高，菌株編號為LPA4-7的產GOD酶活最高，為（7.550±0.283）U/mL，選定菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變篩選。

2.2.2 復合誘變篩選結果

對菌株LPA4-7孢子懸浮液進行DES誘變，然后梯度稀釋涂布斜面培養基平板30℃培養，挑取生長速度較快的8株菌至斜面保存，并將這8株菌接種至液體發酵培養基，30℃、180 r/min發酵5 d，檢測GOD酶活結果如表3所示。

由表3可知，經誘變后，酶活力較菌株LPA4-7提高的菌株有LPA47-3、LPA47-5、LPA47-8 3株，酶活分別比原始菌株LPA-4提高38.76%、55.57%、38.01%。誘變篩選的菌株LPA47-5酶活最高，相同條件下產酶性能在（10.501± 0.254）U/mL，將其命名為菌株Bla-6進行后續試驗。

表3 復合誘變篩選結果Table 3 Screening results of compound mutagenesis

2.3 誘變株Bla-6遺傳穩定性

誘變株進行8次傳代培養，將誘變得到的高產菌株Bla-6連續轉接8代，每傳一代用搖瓶發酵液測定酶活，結果如表4所示。

表4 誘變菌株Bla-6遺傳穩定性試驗結果Table 4 Genetic stability test results of mutant strain Bla-6

誘變菌株存在遺傳性能不穩定的風險，隨著傳代次數的增加產酶性能可能會有所減弱。由表4可知，誘變株Bla-6在1～8代范圍內產GOD酶活較穩定，維持在10.5 U/mL左右，說明誘變菌株具有較好的遺傳穩定性。

2.4 誘變株Bla-6的鑒定

2.4.1 誘變株Bla-6的生長特性

將菌株Bla-6純培養物挑至平板分離培養基上于30℃培養48 h，觀察菌落形態和在顯微鏡下菌株形態，結果見圖1。由圖1可知，菌落生長較快，初白色，產孢后表面黑色，呈粉末狀。分生孢子頭呈球形或近球形，黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，布滿整個頂囊，褐色球形。

圖1 誘變菌株Bla-6的菌落特征(a)和菌株形態(b)Fig.1 Colony characteristics(a)and strain morphology(b)of mutant strain Bla-6

2.4.2 PCR擴增結果

利用引物ITS1和ITS4，菌株Bla-6的ITS區基因PCR擴增到目的片段，在500 bp左右有1條明顯的電泳條帶，如圖2所示。將擴增得到的PCR產物送北京博尚生物技術有限公司進行測序。

圖2 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區序列的PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification product electrophoregram of 5.8 S rDNAITS sequence of strain Bla-6

2.4.3 目的菌株的系統發育分析

將目的菌株Bla-6的5.8S rDNA-ITS區序列在NCBI中進行BLAST分析，并下載相似性最大的序列和該屬內代表種，利用MEGA3.1軟件構建系統發育樹（見圖3）。

圖3 菌株Bla-6的5.8S rDNA ITS區序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA ITS sequence of strain Bla-6

由圖3可知，與GenBank數據庫中曲霉菌相關菌株的ITS區基因序列JF838357.1、HQ850370.1等的5.8S rDNA-ITS區序列比較分析，發現其與曲霉屬（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）親緣關系最近，相似度達99%。綜合菌株的菌落形態、生長特性、鏡檢形態及5.8S rDNA-ITS區序列系統進化分析，確定菌株Bla-6為黑曲霉（Aspergillus niger）。

3 結論

本研究采用平板顯色法初篩和Underbofler滴定法進行復篩，從土壤樣品中得到8株產葡萄糖氧化酶的菌株，通過紫外-硫酸二乙酯復合誘變篩選出一株產GOD酶活性能較好的誘變菌株Bla-6。經過8代傳代培養，誘變菌株Bla-6具有產GOD酶性能較好的遺傳穩定性。采用微生物發酵法生產酶具有在常溫常壓下完成，微生物容易培養、繁殖快，生產和設備投資較少，以及其設備泛用性較廣的優點，故可在短時間內廉價的大量生產。該產葡萄糖氧化酶突變株遺傳性狀穩定，相同發酵條件下搖瓶產酶可達（10.501±0.254）U/mL，比原始菌株LPA-4（6.750 U/mL）提高了55.57%。該研究對產GOD菌株的篩選誘變方法的建立和對菌株產酶遺傳穩定性的研究，為促進黑曲霉產葡萄糖氧化酶工業化生產，提高酶的應用質量，降低生產成本提供了科學依據。

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Mutation screening and genetic stability of glucose oxidase-producing strain

XIN Guoqin,DONG Peipei,WANG Xiangyan,ZHAO Ying,LIU Xiuxia,XU Haiyan*,GU Wei
(Shandong Baolai-leelai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

By preliminary screening of plate coloration,secondary screening of Underbofler titration method,a glucose oxidase-producing strain was obtained from Linyi orchard soil samples,and named as strain Bla-6.The glucose oxidase(GOD)activity produced by strain Bla-6 was(10.50±0.25) U/ml,which was 55.57%higher than that(6.75 U/ml)produced by original strain LPA-4.By the analysis of 5.8S rDNA-ITS gene sequence,colonial morphology,growth characteristics,and mycelial morphology,the results showed that the strain Bla-6 was identified asAspergillus niger.After subculture of 10 successive generations,the GOD activity maintained at about 10.5 U/ml,which showed that the strain had good genetic stability.

glucose oxidase;Aspergillus niger;mutation;genetic stability

Q939.97

0254-5071（2016）11-0069-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.014

2016-05-24

國家高技術研究發展計劃‘863計劃'子課題（2013AA102806）

辛國芹（1985-），女，助理研究員，碩士，主要從事基礎微生態研究工作。

*通訊作者：徐海燕（1975-），女，高級畜牧師，本科，主要從事微生態制劑研發工作。