雷帕霉素抑制人前列腺癌細胞PC－3生長及轉移的實驗研究

辛 華， 于海東， 楊志偉， 王 琳， 劉君星， 江清林

(佳木斯大學附屬第一醫院， 黑龍江 佳木斯 154003)

雷帕霉素抑制人前列腺癌細胞PC－3生長及轉移的實驗研究

辛 華， 于海東， 楊志偉， 王 琳， 劉君星， 江清林

(佳木斯大學附屬第一醫院， 黑龍江 佳木斯 154003)

目的:對人前列腺癌細胞PC－3進行雷帕霉素的藥物試驗，并觀察其對細胞生長及轉移的影響。方法:抽取2012年3月至2013年11月本院經體外培養的人前列腺癌細胞PC－3作為研究樣本，分別采用0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的雷帕霉素對其進行藥物干預，并采用MTT法以及流式細胞儀等檢測措施分別觀察PC－3細胞的增殖、周期以及凋亡等變化。結果:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生長增殖未受到任何抑制作用。分別在12h、24h以及36h的培養時間下，25ng/mL的雷帕霉素濃度具有更高的細胞生長抑制率，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，分別在兩種不同的濃度下，12h、24h以及36h之間兩兩比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。分別在12h、24h以及36h的培養時間下不同濃度的雷帕霉素組間兩兩比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，分別在三種不同濃度下，對不同培養時間的組別進行比較，除了0ng/mL下24h與36h的培養時間下PC－3凋亡作用差異具有統計學意義(P＞0.05)，其他組間兩兩相比均具有統計學意義(P＜0.05)。結論:雷帕霉素對人前列腺癌細胞PC－3具有較好的抑制生長及轉移效果，且濃度越高，培養時間越長，效果越明顯。

雷帕霉素； 人前列腺癌細胞； PC－3； 轉 移

本次實驗主要通過對人前列腺癌細胞進行雷帕霉素的藥物實驗，觀察其對癌細胞增殖生長以及侵襲轉移的影響，具體如下。

1　資料與方法

1.1一般資料:抽取2012年3月至2013年11月本院經體外培養的人前列腺癌細胞PC－3作為研究樣本。所有細胞樣本均具有穩定的生長速度，選擇IlyClone公司的RPMI－1640培養基對細胞進行培養，該培養基主要含有10%的胎牛血清、1%的鏈霉素以及1%的青霉素[1]。進而采用胰酶進行消化，傳代培養，并取對數期生長的細胞進行實驗。

1.2方 法

1.2.1藥物濃度的設置:將雷帕霉素藥物分別按照0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的三種不同濃度溶于培養液中進行培養，并將0mg/L的組為對照組。

1.2.2采用MTT法對PC－3細胞增殖生長的測定:取對數期生長的PC－3細胞，沖洗消化后，將其與96孔培養板內進行接種，1000個細胞每孔，并于孵箱中繼續培養24h，保持5%的二氧化碳濃度以及37℃的箱溫。之后，除去培養液，將三種不同濃度的雷帕霉素溶液分別加入每孔內，為保證實驗的準確性，每個濃度的試驗可在6個重復孔內進行，繼續在溫育下分別培養12h、24h以及36h。將5mg/mL的MTT分別加入每孔中，20μl每孔，繼續培育4h，取出上清液，在將DMSO分別加入每孔中，150μl每孔。10min后常規進行PC－3細胞生長增殖抑制率的計算，依據公式:抑制率＝[(對照組OD值－本底OD值)－(實驗組OD值－本底OD值)?/(對照組OD值－本底OD值)]×100%[2]。

1.2.3流式細胞術FCM對PC－3細胞周期變化的檢查:將PC－3細胞接種于細胞培養瓶(25cm2的容量)內，配置1×106/mL的細胞濃度，置于5%的二氧化碳濃度以及37℃的環境下進行培養，24h后除去培養液，再將其置于4℃的環境下培養，以保證細胞的同步化生長，2h后分別將不同濃度的2.5mL雷帕霉素溶液對應加入各瓶內，再次孵育12h、24h以及36h后，取出舊培養液，并采用磷酸鹽緩沖液對培養瓶進行沖洗，常規消化處理，再將1.5mL的枸櫞酸溶液加入其中，配置1 ×106/mL的懸液細胞，再次進行磷酸鹽緩沖液的沖洗，之后對其進行5min的離心處理，取出細胞，并采用70%的乙醇進行固定。再次進行5min的離心處理，收集固定細胞，去除上清液。在避光環境下加入Binding Buffer，30min后再加入PI，5min后再次加入Binding Buffer，隨后采用流式細胞儀進行細胞死亡率以及凋亡率的檢測。

1.3觀察指標:①觀察不同濃度的雷帕霉素對人前列腺癌細胞增殖生長的抑制情況，并將12h、24h以及36h的不同培養時間下的抑制效果進行比較。②觀察不同濃度的雷帕霉素對人前列腺癌細胞凋亡的影響，并將12h、24h以及36h的不同培養時間下的凋亡作用進行比較。

1.4統計學方法:采用SPSS19.0軟件，計量資料以均數±標準差(±s)表示，計數資料以率表示，組間比較采用F檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結 果

2.1不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對PC－3生長增殖抑制的影響:在0ng/mL的雷帕霉素下，PC－3的生長增殖未受到任何抑制作用。分別在12h、24h以及36h的培養時間下，25ng/mL的雷帕霉素濃度具有更高的細胞生長抑制率，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，隨著雷帕霉素濃度的逐漸增高，PC－3的生長抑制效果越好。分別在兩種不同的濃度下，12h、24h以及36h之間兩兩比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，培養時間越長，PC－3的增殖抑制效果更好。見表1。

表1　不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對細胞生長抑制率的影響(±s)

表1　不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對細胞生長抑制率的影響(±s)

注:F＞2時組間相比具有統計學意義(P＜0.05)

雷帕霉素濃度12h24h36hF 10ng/mL17.9±0.3ab28.1±1.1c32.0±0.52.584 25ng/mL24.8±1.2de34.5±1.3f43.2±0.92.610 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.2不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對PC－3細胞凋亡的影響:分別在12h、24h以及36h的培養時間下對不同濃度的雷帕霉素對PC－3細胞的凋亡作用進行觀察，發現組間兩兩比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，隨著濃度的不斷升高，對PC－3細胞凋亡的作用越明顯。同時分別在三種不同濃度下，對不同培養時間的組別進行比較，相關數據相比均具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2　不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對PC－3細胞凋亡的影響(±s)

表2　不同濃度雷帕霉素在不同培養時間下對PC－3細胞凋亡的影響(±s)

注:F＞2時組間相比具有統計學意義(P＜0.05)

雷帕霉素濃度12h24h36hF 0ng/mL3.8±0.2ab5.9±0.4c6.1±0.62.537 10ng/mL10.8±0.3de17.7±0.9f20.6±0.83.227 25ng/mL14.9±0.5gh21.3±1.0i28.5±1.23.970 F2.8212.0983.550 P＜0.05＜0.05＜0.05

3　討 論

雷帕霉素屬于一類新型的大環內酯類免疫抑制劑，可通過阻斷不同細胞因子間的傳導信號，破壞癌細胞的生長進程，從而起到較好的抑制生長及侵襲轉移的作用[3]。本次試驗通過細胞培養，探討不同濃度的雷帕霉素對PC－3細胞的生長抑制及轉移效果。0ng/ mL的雷帕霉素未對PC－3的生長增殖起到任何抑制作用，然而在不同的雷帕霉素濃度下，PC－3的生長抑制率各不相同，濃度越高，其抑制效果越好。然而不同的培養時間也對PC－3的生長抑制具有不同的效果，培養時間越長，其抑制率越高，如此次試驗中分別在兩種不同的濃度下，差異顯著，說明培養時間越長，PC－3的增殖抑制效果更好。雷帕霉素對PC－3的凋亡作用于生長抑制作用形似，分別在12h、24h以及36h的培養時間下對不同濃度的雷帕霉素對PC－3細胞的凋亡作用進行觀察，濃度越高，PC－3凋亡作用越強。同時，分別在三種不同濃度下，對不同培養時間的組別進行比較，均表現為培養時間越長，PC－3凋亡作用越顯著。

[1] 邊躍俊.前列腺特異抗原(PSA)檢測的臨床應用[J].哈爾濱醫藥，2005，25(6):94～96.

[2] 韓嬌艷.鹽酸川芎嗪通過mTOR信號通路和凋亡通路抑制前列腺癌PC－3細胞的增殖[D].重慶醫科大學，2013.

[3] 姚雙，康曉明，李麗，等.雷帕霉素對大鼠慢性腎間質纖維化中HGF、TGF－β的表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3):11～12.

1006－6233(2016)11－1891－02

A 【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.11.059

黑龍江省自然科學基金項目，(編號:D201225)；佳木斯大學科學技術重點項目，(編號:12Z1201504)

江清林，E－mail:jqljms＠126.com