EIF2AK2和NLRP3相互作用影響細胞分泌IL-1β的研究

鞠小麗，王 強

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EIF2AK2和NLRP3相互作用影響細胞分泌IL-1β的研究

鞠小麗1，王 強2

目的 研究真核細胞翻譯起始因子2AK2(EIF2AK2)蛋白對Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥體激活及細胞分泌IL-1β的影響。方法 在HEK-293細胞中，通過轉染凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)、NLRP3、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和促白細胞介素-1β(pro-IL-1β)基因構建NLRP3炎癥體，并檢測EIF2AK2蛋白過表達對細胞分泌炎癥性細胞因子IL-1β的影響；通過免疫共沉淀研究EIF2AK2蛋白和NLRP3蛋白相互作用。最后在人單核THP-1細胞中通過siRNA干擾驗證EIF2AK2對IL-1β分泌水平的影響。結果 在HEK-293細胞中，過表達EIF2AK2蛋白能激活NLRP3炎癥體后誘導細胞分泌IL-1β，并且IL-1β分泌水平隨EIF2AK2表達水平提高而增加。免疫共沉淀結果顯示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白發(fā)生相互作用。THP-1細胞中siRNA干擾抑制EIF2AK2表達后發(fā)現細胞分泌IL-1β減少。結論 EIF2AK2蛋白能調控NLRP3炎癥體的激活從而影響細胞分泌促炎癥因子IL-1β。

NLRP3炎癥體; EIF2AK2; IL-1β分泌; 蛋白相互作用

先天免疫系統通過各種模式識別相關分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)識別各種病原體后抵抗病原體入侵[1]。炎癥體是一種由模式識別相關分子組成的大分子復合物。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-containing aspartate-specific proteases-1，caspase-1)組成的分子量約為700 ku的大分子復合物[2-3]。目前研究[4]顯示多種PAMP如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、單鈉尿酸鹽晶體(monosodium urate,MSU)、 膽固醇結晶、 β淀粉樣蛋白等內源性危險信號都能引起 NLRP3炎癥體的激活。NLRP3炎癥體異常激活參與多種代謝異常疾病如Ⅱ型糖尿病、阿爾茨海默病和動脈粥樣硬化等[5]。NLRP3炎癥體激活3種模型：線粒體 DNA 假說、活性氧假說和溶酶體破裂假說[4]。已報道SGT1和Hsp90[6]、TXNIP、TRIM30[7]和GPSM3等蛋白能和NLRP3相互作用從而調節(jié)NLRP3炎癥體激活。真核細胞翻譯起始因子2AK2(eukaryotic translation initiation factors 2AK2, EIF2AK2)最初發(fā)現是一個病原識別分子, 該蛋白N末端能和雙鏈RNA結合誘導C末端催化區(qū)域活化[8]。該研究通過在HEK-293細胞中重構NLRP3炎癥體研究EIF2AK2在NLRP3炎癥體激活中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎細胞HEK-293和人單核細胞 THP-1購自美國菌種保藏中心(ATCC)；DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；人IL-1β ELISA 試劑盒購自美國BD公司；MSU和ATP購自美國Sigma公司；HA和Flag抗體購自美國CST公司; 二抗購自美國Invitrogen公司。

1.2 NLRP3炎癥體在HEK-293細胞中構建 通過基因特異性引物分別從人的cDNA中擴增ASC、 NLRP3、 Caspase-1和促白細胞介素-1β(pro-interleukin-1β, pro-IL-1β)基因并克隆到pMD18-T載體上。隨后分別用BamHⅠ和XhoⅠ進行酶切后連接到用相同酶切的真核表達載體pcDNA3，分別得到pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β重組體。按1×105個細胞/孔將細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。 第2天分別將10 ng pcDNA3-ASC、20 ng pcDNA3-NLRP3、 5 ng pcDNA3-Caspase-1和100 ng pcDNA3-pro-IL-1β重組體通過X-tremeGENE HP共轉染HEK-293細胞。轉染后24 h分別收集的上清液，通過ELISA法檢測HEK-293細胞分泌IL-1β水平。在研究EIF2AK2對IL-1β分泌影響實驗中，除了按上面將pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β共轉染HEK-293細胞外，還將25～200 ng的pcDNA3-HA-EIF2AK2的共轉染HEK-293細胞，轉染后 24 h分別收集細胞上清液并檢測HEK-293細胞分泌IL-1β水平。

1.3 免疫沉淀反應 將克隆到pMD18-T載體的EIF2AK2和NLRP3基因分別通過BamH I和Xho I位點克隆到pEAK-HA和pCMV-Tag 2，隨后克隆到pcDNA3上形成含HA標簽的pcDNA3-HA-EIF2AK2重組體和Flag標簽的cDNA3-Flag-NLRP3重組體。按1×106個細胞/孔將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。將pcDNA3-HA-EIF2AK2和pcDNA3-Flag-NLRP3重組體共轉染細胞。轉染 48 h后收集細胞，用預冷的PBS液沖洗細胞2遍后，用1 ml 含1% NP-40的細胞裂解液在冰上裂解細胞30 min。收集細胞上清液后加入1 μg小鼠抗 Flag單克隆抗體,4 ℃旋轉混合2 h , 加入 20 μl蛋白A繼續(xù)混合過夜, 離心后去上清液, 用細胞裂解液洗滌沉淀 3遍, 加入 20 μl的SDS-PAGE上樣緩沖液, 煮沸 5 min,進行SDS-PAGE電泳。

1.4 Western blot法檢測 細胞經RIPA裂解液裂解后收集上清液獲得細胞總蛋白，并通過BCA方法進行蛋白定量。將20 μl蛋白樣品上樣后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后用半干電轉儀轉膜, 5%脫脂奶粉封閉 1 h , 然后加入1 ∶2 000稀釋的兔抗 HA 多克隆抗體,4 ℃孵育過夜, 用 0.5% TBST洗膜3次, 加入 1 ∶10 000稀釋的羊抗兔二抗, 室溫孵育1 h,用0.5% TBST洗膜3次, 按照操作說明, 加入化學發(fā)光液, 進行凝膠成像顯影。

1.5 siRNA干擾EIF2AK2及對IL-1β的分泌 根據人的EIF2AK2基因序列，按照siRNA 的設計原則分別設計兩對siRNA(正義引物: 5′-CAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAA-3′; 反義引物: 5′- GGACCTCCACATGATAGGAGGTTTA- 3′)，并交由美國Invitrogen公司合成。按1×106個細胞/孔將細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μl培養(yǎng)基。將20 mol/L的siRNA 用Invitrogen細胞電轉儀Neon Transfection System(MPK5000)進行轉染。轉染48 h后，收集細胞并提取RNA進行半定量PCR檢測EIF2AK2表達水平。同時將5×104個細胞/孔將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L的ATP刺激6 h和3 h后，收集細胞上清液，通過ELISA法檢測細胞分泌IL-1β水平。

2 結果

2.1 HEK-293細胞中過表達EIF2AK2誘導細胞分泌IL-1β Western blot結果顯示EIF2AK2能在HEK-293細胞中過表達(圖1A)。將10 ng ASC、20 ng NLRP3、5 ng Caspase-1和100 ng pro-IL-1β共轉染HEK-293細胞24 h后，ELISA結果顯示炎癥體復合物能誘導IL-1β分泌(圖1B)。為了研究EIF2AK2是否影響NLRP3炎癥體激活和IL-1β的分泌，將 EIF2AK2、 ASC、NLRP3、 Caspase-1和pro-IL-1β共轉染HEK-293細胞，結果顯示EIF2AK2能顯著誘導細胞分泌IL-1β(圖1B)。

2.2 EIF2AK2促進IL-1β分泌具有濃度依賴性 將0～100 ng 的EIF2AK2和NLRP3炎癥體復合物共轉染HEK-293細胞24 h后，Western blot結果顯示EIF2AK2表達水平隨著轉染pcDNA3-HA-EIF2AK2重組體的量增加而增加(圖2A)。 ELISA檢測顯示25～100 ng的EIF2AK2能促進細胞分泌IL-1β，并且細胞分泌IL-1β水平隨著EIF2AK2濃度的增加而增加(圖2B)。

2.3 EIF2AK2和NLRP3蛋白相互作用 將Flag標簽的NLRP3蛋白和HA標簽的EIF2AK2蛋白共轉染HEK-293細胞，通過免疫共沉淀顯示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白發(fā)生相互作用(圖3)。而對照IgG并未檢測到條帶，說明EIF2AK2和NLRP3發(fā)生特異的相互作用。

圖1 HEK-293細胞過表達EIF2AK2對IL-1β分泌影響

A：Western blot法檢測EIF2AK2表達水平；B：ELISA法檢測IL-1β分泌水平；1：空載體；2：pcDNA3-HA-EIF2AK2

圖2 HEK-293細胞中EIF2AK2蛋白表達水平對IL-1β分泌的影響

A：Western blot法檢測EIF2AK2表達水平；B: ELISA法檢測IL-1β分泌水平；1～4：細胞分別轉染0、25、50、100 ng pcDNA3-HA-EIF2AK2載體

圖3 HEK-293細胞中EIF2AK2和NLRP3免疫共沉淀結果

2.4 siRNA干擾EIF2AK2表達后抑制IL-1β的分泌 在人單核THP-1細胞中分別轉染EIF2AK2(#1和#2)和對照siRNA，轉染48 h后RT-PCR結果顯示EIF2AK2基因表達水平被顯著抑制(圖4A)。將這些細胞分別用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L 的ATP刺激6 h和3 h后， EIF2AK2干擾的THP-1細胞比對照細胞分泌的IL-1β明顯減少(圖4)。

圖4 THP-1細胞中siRNA干擾EIF2AK2后RT-PCR檢測基因表達水平(A)及ELISA法檢測IL-1β分泌水平(B)

1：對照siRNA；2：siRNA EIF2AK2#1；3：siRNA EIF2AK2#2

3 討論

NLRP3炎癥體激活是一個復雜的過程，涉及到一系列事件。不同的微生物和代謝產物激活NLRP3炎癥體的機制也不同[4]。如尿酸鈉晶體和二氧化硅通過鈣離子外流激活NLRP3炎癥體[9-10]， 胰島淀粉樣多肽則通過活性氧激活NLRP3炎癥體[11]，而β淀粉樣蛋白則通過溶酶體破裂激活炎癥體[12]。目前還沒有發(fā)現NLRP3能直接識別這些配體而激活炎癥體。推測可能通過不同上游信號激活NLRP3炎癥體，因此研究調節(jié)NLRP3炎癥體激活的蛋白具有重要意義。目前已發(fā)現兩類調節(jié)NLRP3炎癥體的蛋白。一類包括熱蛋白、POP 和病毒熱蛋白(vPYDs)等具有PYD結構域的蛋白；另一類為包括 Iceberg、COP1、INCA和 Caspase-12 等含有CARD結構域的蛋白。本研究中顯示的負調節(jié)蛋白雖然不含有這兩個結構域，但已有的研究[13]顯示EIF2AK2是一個病原識別受體，該蛋白的N末端能和雙鏈RNA病毒相結合后激活C末端催化區(qū)域。同時亦顯示該蛋白N末端還能識別許多非病毒類刺激，如脂肪酸、細胞外ATP和二氧化硅晶體等[13]。本研究顯示在THP-1細胞中，抑制EIF2AK2表達后能促進ATP誘導的THP-1細胞中IL-1β分泌，推測ATP可能通過激活EIF2AK2從而影響炎癥激活，最終影響細胞分泌IL-1β。具體的機制將在以后的研究中進一步驗證。

NLRP3炎癥體由NLRP3蛋白、接頭蛋白ASC和效應蛋白 Caspase-1 組成復合體。本研究顯示EIF2AK2蛋白能和炎癥體的NLRP3蛋白相互作用，然而并不清楚該蛋白是否和炎癥體中其它蛋白如ASC等相互作用，今后的研究方向將會進一步研究該蛋白調節(jié)炎癥體激活的具體機制。NLRP3 炎癥體和一系列的代謝疾病有關，雖然對NLRP3炎癥體激活有了較多的認識，但針對NLRP3炎癥體仍有許多問題需要研究解決，其中重要的問題之一就是炎癥體如何被精確的調控，本研究顯示EIF2AK2蛋白能調節(jié)NLRP3炎癥體將為炎癥體相關的疾病預防提供新的思路。

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Investigation of EIF2AK2 interaction with NLRP3 and effect on the release of IL-1β

Ju Xiaoli1,Wang Qiang2

(1SchoolofMedicine,2InstituteofLifeSciences,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofEIF2AK2ontheactivationofNLRP3inflammasomeandthereleaseofIL-1β.MethodsNLRP3inflammasomewasre-constructedinHEK-293cellstoexaminethereleaseofIL-1βbyoverexpressionofEIF2AK2.Theco-immunoprecipitationwasperformedtoinvestigatetheinteractionbetweenEIF2AK2andNLRP3.FinallysiRNAofEIF2AK2inTHP-1cellswasperformedtoexaminethereleaseofIL-1β.ResultsOverexpressionofEIF2AK2inHEK-293cellsactivatedNLRP3inflammasomeandincreasedIL-1βrelease.IL-1βreleaseincreasedgreatlywhenexpressionlevelofEIF2AK2increased.Theco-immunoprecipitationresultsdemonstratedthatEIF2AK2interactedwithNLRP3inHEK-293cells.IL-1βreleasewasreducedwhenEIF2AK2expressionwasinhibitedbysiRNAinTHP-1cells.ConclusionTheseresultssuggestthatEIF2AK2regulatestheactivationofNLRP3inflammasomeandthenaffectsIL-1βrelease.

NLRP3inflammasome;EIF2AK2;IL-1βrelease;proteininteraction

國家自然科學基金(編號：81502621、81502088)，江蘇省自然科學基金(編號：BK20140539)，江蘇大學高級人才啟動基金項目((編號：14JDG065、15JDG021)，中國博士后科學基金(編號：2015M571677)

江蘇大學1醫(yī)學院病理教研室、2生命科學研究院，鎮(zhèn)江 212013

鞠小麗，女，講師； 王 強，男，助理研究員，碩士生導師，責任作者，wanqqiang@ujs.edu.cn

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.003.html

R 392.11

A

1000-1492(2016)11-1565-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.003

2016-06-12接收